Choć Matejko i jego rodzeństwo z pochodzenia w połowie byli po ojcu Czechami, a po matce – spolonizowanymi Niemcami, rozmawiali w domu rodzinnym po polsku. Dwaj starsi bracia Jana, Edmund i Zygmunt, byli uczestnikami powstania węgierskiego (1848–1849). Zygmunt poległ na polu walki.
W wieku trzynastu lat Jan Matejko został przyjęty do krakowskiej Szkoły Sztuk Pięknych przy ulicy Wesołej, której dyrektorem był wówczas Wojciech Stattler. Przejawiał w szkole ogromną ambicję i pracowitość, choć także tam jego edukacja nie przebiegała gładko, na co zapewne wpływ miała antypatia, jaką darzył go początkowo Stattler, a także trudności finansowe i znaczna wada wzroku. Wpływ na młodego malarza wywarli natomiast inni nauczyciele: Józef Kremer i Władysław Łuszczkiewicz, którzy zainspirowali go do szkicowania krakowskich zabytków, zbierania materiałów, studiowania detali i obrazów, tworząc tzw. Skarbczyk.