Obsada Tobey Maguire jako Peter Parker / Spider-Man, superbohater, genialny student fizyki na Uniwersytecie Columbia i fotograf dla Daily Bugle, któremu pozaziemski symbiont przyczepia się do kostiumu, wpływając negatywnie na jego zachowania. Kirsten Dunst jako Mary Jane Watson, dziewczyna Petera Parkera i aktorka na Broadwayu, w której zakochany jest od dzieciństwa. James Franco jako Harry Osborn / Nowy Goblin, syn Normana Osborna i najlepszy przyjaciel Parkera, który uważa, że Spider-Man zamordował jego ojca. Kiedy dowiedział się, że Parker jest Spider-Manem, a jego ojciec był Zielonym Goblinem, Harry staje się Nowym Goblinem, by zmierzyć się ze swoim dawnym przyjacielem. Thomas Haden Church jako Flint Marko / Sandman, drobny złodziej, który ma żonę i chorą córkę dla których kradnie pieniądze, by pomóc w leczeniu.