La reacció en cadena de la polimerasa (coneguda com a PCR, les sigles angleses de polymerase chain reaction) és una tècnica de biologia molecular l'objectiu de la qual és obtenir un gran nombre de còpies d'un fragment d'ADN específic a partir d'una quantitat mínima. Avui en dia, la tecnologia és capaç de fer-ho a partir d'una sola còpia. El procés fou descobert el 1983 per Kary Banks Mullis, guardonat amb el Premi Nobel de Química.
Aquesta tècnica serveix per amplificar un fragment d'ADN. La seva utilitat rau en el fet que després de l'amplificació resulta molt més fàcil identificar amb una gran precisió els virus o organismes que causen les malalties. També serveix per identificar cadàvers i per la investigació científica sobre l'ADN amplificat. Aquests usos derivats de l'amplificació l'han convertit en una tècnica molt estesa, amb el consegüent abaratiment de l'equip necessari per dur-la a terme.
En el camp d'aplicacions de la tècnica PCR es poden citar: clonació d'ADN aplicada a la seqüenciació d'ADN, clonació i manipulació de gens, mutagènesi gènica; construcció de basats en l'ADN filogènies o anàlisi funcional de gens; diagnòstic i seguiment de malalties hereditàries; amplificació de mostres escasses d'ADN; anàlisi d'empremtes genètiques per al perfilatge d'ADN (per exemple, en ciències forenses i proves de paternitat); i detecció de patògens en proves d'àcid nucleic per al diagnòstic de malalties infeccioses.
Història miniatura|Electroforesi de proteïnes SDS-PAGE resolent la Taq polimerasa. El 1971, un article publicat per Klepp et al. a Journal of Molecular Biology descrigué per primera vegada un mètode que utilitzava enzims per replicar una seqüència petita d'ADN amb encebadors in vitro. Tanmateix, aquest primer exemple del principi bàsic de la PCR no rebé gaire atenció i la invenció de la reacció en cadena de la polimerasa el 1983 és atribuïda generalment a Kary Mullis.
Un concepte que cal tenir en compte en la PCR és que l'ADN polimerasa que s'utilitza ha de ser capaç de suportar les altes temperatures de més de 90 °C necessàries per a la separació dels dos brins d'ADN de la doble hèlix després de cada cicle de replicació. Les ADN polimerases utilitzades originàriament als experiments in vitro previs a la PCR no eren capaces de suportar aquestes altes temperatures, de manera que els primers procediments per replicar l'ADN eren molt ineficients i llargs i requerien grans quantitats d'ADN polimerasa.
El descobriment l'any 1976 de la Taq polimerasa, una polimerasa d'ADN extreta de l'eubacteri termòfil Thermus aquaticus que viu en medis molt calents (50-80 °C), eliminà els grans inconvenients del mètode de la PCR. Aquesta ADN polimerasa és estable a altes temperatures, car roman activa fins i tot després de la desnaturalització de l'ADN, eliminant la necessitat d'afegir més polimerasa a la reacció després de cada cicle. Aquest descobriment permeté l'automatització del procés, abans tant tediós, acoblat a l'ús del termociclador.
Alhora que es desenvolupava la PCR el 1983, Mullis treballava a Emeryville (Califòrnia) per una de les primeres empreses biotecnològiques, Cetus Corporation, on s'encarregava de sintetitzar cadenes curtes d'ADN. Mullis afirmà que concebé la idea de la PCR una nit mentre recorria en cotxe l'Autopista de la Costa del Pacífic. Estava imaginant una nova forma d'analitzar mutacions en l'ADN quan s'adonà que, en lloc d'això, havia inventat un mètode per amplificar regions específiques d'ADN mitjançant cicles de duplicació repetits utilitzant ADN polimerases. Mullis atribueix la invenció d'aquesta tècnica als efectes de la droga psicodèlica i al·lucinògena LSD.
Mullis resumí el procediment a la revista Scientific American: «Començant amb una única molècula del material genètic d'ADN, la PCR pot generar 100.000 milions de molècules iguals en una tarda. La reacció és fàcil, car no requereix més que un tub d'assajos, uns quants reactius simples i una font de calor». Fou guardonat amb el Premi Nobel de Química del 1993 per la seva invenció Discurs del Premi Nobel de Kary Mullis, 8 de desembre del 1993 i, set anys després, ell i els seus companys de Cetus dugueren a la pràctica la seva proposta.
Guerres de patents La tècnica de la PCR fou patentada per Cetus Corporation, on Mullis treballava quan la inventà l'any 1983. L'enzim Taq polimerasa també fou blindada amb patents. Hi hagué diversos plets relacionats amb la tècnica, incloent-hi un plet fracassat encetat per DuPont. La companyia farmacèutica Hoffmann-La Roche adquirí els drets de les patents el 1992 i actualment conserva les que encara estan protegides.PR NewswireConsejos sobre como sobrevivir a la guerra de las patentes de Taqs : GEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Articles. 1 de maig del 2006 (vol. 26, no. 9).
Fonaments i importància
Aquesta tècnica es basa en la propietat natural de les ADN polimerases per replicar brins d'ADN, utilitzant cicles que alternen temperatures altes i baixes per separar entre ells els brins d'ADN formats després de cada fase de replicació i, a continuació, deixant que es tornin a unir a les polimerases per tornar-se a duplicar.
Inicialment la tècnica era lenta, car les polimerases es desnaturalitzaven en realitzar els canvis de temperatura i calia afegir més polimerases a cada cicle. Com que les temperatures del cicle (95 °C a les fases de desnaturalització de l'ADN) comporten la desnaturalització immediata de gairebé qualsevol proteïna, es fan servir ADN polimerases termoestables extretes de microorganismes adaptats per viure a aquestes temperatures, destructives per la majoria d'éssers vius. Aquests microorganismes, generalment arqueus, són: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (PFU), Thermococcus litoralis (Vent) i Thermus termophilus (Tth). Generalment s'utilitzen mescles de polimerases molt processades (Taq) amb altres amb correcció d'errors (PFU, Vent).
miniatura|Un termociclador, l'aparell en què s'efectua una PCR convencional miniatura|Tubs de PCR que contenen la barreja en un volum total de 100 μL Avui en dia, tot el procés de la PCR està automatitzat mitjançant un aparell anomenat termociclador, que permet escalfar i refredar els tubs de reacció per controlar la temperatura necessària a cada etapa de la reacció (vegeu més avall). Molts termocicladors moderns utilitzen l'efecte Peltier, que permet tant escalfar com refredar els tubs simplement invertint el corrent elèctric. Els tubs utilitzats a les PCR tenen una paret molt fina que afavoreix una bona conductivitat tèrmica, permetent assolir ràpidament l'equilibri tèrmic. Gairebé tots els termocicladors tenen un sistema que escalfa la tapa de tancament per tal d'evitar condensació sobre els tubs de reacció. Els termocicladors més antics que no tenien aquest sistema solucionaven el problema de la condensació amb una capa d'oli a la part superior de la mescla de reacció o una mica de cera dins dels tubs.
En general, la PCR és una tècnica comuna i normalment indispensable en un laboratori d'investigació mèdica i biològica per una gran varietat d'aplicacions, que inclouen la clonació d'ADN per la seva posterior seqüenciació, la filogènia basada en l'ADN, l'anàlisi funcional de gens, el diagnòstic de trastorns hereditaris, la identificació d'empremtes genètiques (utilitzada en tècniques forenses i tests de paternitat) i la detecció i diagnòstic de malalties infeccioses.
Reactius La tècnica requereix els reactius següents:
Desoxinucleòtids trifosfats (dNTP), el substrat per la polimerització del nou ADN. Dos encebadors oligonucleòtids, cadascun dels quals és complementari a un dels dos brins d'ADN. Són seqüències curtes d'entre 6 i 40 nucleòtids, normalment entre 18 i 22, que són reconegudes per la polimerasa permetent iniciar la reacció. Han d'estar situats l'un davant l'altre i a poca distància. Delimiten la zona d'ADN per amplificar. Ions divalents. Se sol utilitzar magnesi (Mg+2), agregat comunament en forma de clorur de magnesi (MgCl₂) o un altre catió divalent. També es pot emprar manganès (Mn+2) per mutagènesi de l'ADN mitjançant PCR, car les altes concentracions de Mn+2 incrementen la taxa d'error durant la síntesi d'ADN. Actuen com a cofactors de la polimerasa. Ions monovalents, com el potassi. Una solució amortidora que manté el pH adequat pel funcionament de l'ADN polimerasa. ADN polimerasa o mescla de diferents polimerases amb temperatura òptima al voltant de 70 °C (la més comuna és la Taq polimerasa). ADN motlle, que conté la regió d'ADN per amplificar. Termociclador, l'aparell que manté la temperatura necessària a cadascuna de les etapes que formen un cicle.
Cicle d'ampliació miniatura|Esquema general de la PCR. miniatura|Grau d'amplificació segons el nombre de cicles emprats. A: gel d'agarosa (1: escala, 2: producte específic, 3: producte inespecífic); B concentració d'ADN al llarg del temps; C logaritme de la concentració d'ADN al llarg del temps. El procés de la PCR consisteix en general en una sèrie de 20 a 35 canvis repetits de temperatura anomenats cicles; cada cicle sol consistir en 2-3 passos a diferents temperatures. La PCR comuna es realitza amb cicles que tenen tres passos de temperatura. Els passos de cada cicle sovint són precedits per un xoc tèrmic (anomenat "temps de manteniment") d'alta temperatura (> 90 °C), i seguit per un altre temps de manteniment al final del procés per l'extensió de producte final o el breu emmagatzematge. Les temperatures utilitzades i el temps aplicat a cada cicle depenen d'una gran varietat de paràmetres, incloent-hi els enzims utilitzats per la síntesi de l'ADN, la concentració d'ions divalents, els dNTP a la reacció i la temperatura d'unió dels encebadors, així com la longitud de l'ADN que es desitja amplificar.
Inicialització. Aquest pas consisteix a escalfar la reacció fins a una temperatura de 94-96 °C (o 98 °C si s'està utilitzant una polimerasa termoestable extrema), que es manté durant 1-9 minuts. Això només és necessari per a l'ADN polimerasa, que requereix l'activació per calor.
Desnaturalització. En primer lloc es desnaturalitza l'ADN (se separen els dos brins que el componen). Aquest pas es pot fer de diferents maneres; l'escalfament de la mostra a 94-95 °C és la més habitual. La temperatura a la qual es decideix realitzar la desnaturalització depèn, per exemple, de la proporció de GC de la cadena o de la seva llargada. Altres mètodes, rarament emprats en la tècnica de la PCR, serien l'addició de sals o agents químics capaços de realitzar la desnaturalització.
Alineament/unió de l'encebador. A continuació es produeix la hibridació de l'encebador, és a dir, l'encebador és acoblat a la seva seqüència complementària de l'ADN motlle. Per fer-ho, cal baixar la temperatura a 50-65 °C durant 20-40 segons (segons el cas), permetent així l'alineament. Els ponts d'hidrogen estables entre les cadenes d'ADN (unió ADN-ADN) només es formen quan la seqüència de l'encebador és molt similar a la de l'ADN motlle. La polimerasa uneix l'híbrid de la cadena motlle i l'encebador i comença a sintetitzar ADN. Els encebadors actuen com a límits de la regió de la molècula per amplificar.