Les tubulina-tirosina carboxipeptidases (TCP) són un grup d'enzims que participen en el cicle de tirosinació/destirosinació de la tubulina. Aquest cicle consisteix en l'extracció de la tirosina C-terminal de l'α-tubulina per part de la TCP i la posterior re-addició d'aquesta tirosina per part de la tubulina-tirosina ligasa (TTL). Aquesta tirosinació/destirosinació és un senyal regulador important per a la mitosi, la fisiologia neuronal i per a la mecanotransducció muscular. Consegüentment, nivells anormals de la destirosinació reversible s'han relacionat amb càncer, cardiomiopaties i desorganització neuronal.
Història El 1977 es considerava que havia d'existir un enzim que tingués com a funció biològica destirosinar la α-tubulina, donant lloc a α-tubulina tirosinada (Tyr-tubulina), prèvia a la destirosinació, i α-tubulina destirosinada (Glu-tubulina), que no presenta tirosina (Tyr) a l'extrem carboxílic, sinó glutamat (Glu). Aquest grup d'enzims teòrics es van anomenar tubulina carboxipeptidases (TCP). Tot i això, no s'havia aconseguit aïllar cap enzim amb aquesta funció.
El 2017, es van aïllar dos enzims ja coneguts, la vasohibina-1 (VASH1) i la vasohibina-2 (VASH2), que associats a la proteïna SVBP (de l'anglès small vasohibin binding protein), destirosinen l'α-tubulina. Per això alguns autors es refereixen als complexos enzimàtics VASH1/SVBP i VAH2/SVBP amb els termes tubulina-tirosina carboxipeptidasa 1 i 2, respectivament.
Microtúbuls, tubulina i un enzim no identificat anomenat tubulina-tirosina carboxipeptidasa. miniatura|Estructura polimèrica del microtúbul: El cilindre buit està compost per dues subunitats proteiques, α-tubulina i β-tubulina, que s'associen formant heterodímers. L'any 1966, Keith Porter va demostrar que al citoplasma de les cèl·lules existia una xarxa filamentosa de proteïnes anomenada citoesquelet (format per microfilaments, filaments intermedis i microtúbuls) que donava suport i dinamisme a la cèl·lula. Els microtúbuls són les fibres més grans (diàmetre 25 nm) i són estructures polimèriques de proteïnes tubulars en forma de cilindre buit. Cada proteïna tubular o tubulina està composta per dues subunitats proteiques, α-tubulina i β-tubulina, que s'associen formant heterodímers. Es troben diferents isòtops codificats per gens diferents tant a l'α-tubulina com a la β-tubulina. Existeixen en humans isotips de 7α-tubulina i 8β-tubulina que difereixen en la seva seqüència C-terminal i presenten especificitat tissular. Els isotips d'α-tubulina presenten un residu de tirosina al final de la seqüència C-terminal del qual manquen els isotips de β-tubulina. Els microtúbuls compleixen funcions essencials en la divisió, forma i motilitat cel·lular, posicionament d'orgànuls i transport intracel·lular. Aquestes funcions cel·lulars estan regulades per modificacions bioquímiques dels aminoàcids conegudes com a modificacions post-traduccionals de les proteïnes, que succeeixen a diferents llocs de les cèl·lules i són executades per molts enzims diferents.
A la dècada dels anys setanta, l'equip dirigit per Héctor S. Barra, de la Universitat de Córdoba (Argentina), va ser pioner a investigar la modificació post-traduccional de proteïnes com a fenomen biològic. Van descriure els mecanismes bioquímics de la tirosinació i la destirosinació i van observar que aquesta modificació s'efectuava sobre la tubulina dels microtúbuls.
El 1977, H.S. Barra i els seus col·laboradors també van demostrar que un enzim, encara no identificat, que van denominar tubulina carboxipeptidasa (TCP), feia la reacció de destirosinació de la tubulina, mentre que un altre enzim, la tubulina-tirosina ligasa (TTL), feia la reacció inversa o tirosinació. De l'enzim TTL es coneix la seva seqüència genòmica i ha estat objecte de nombrosos estudis.
La Glu-tubulina apareix en els microtúbuls estables (axonema, cossos basals, centríols, centrosoma, cilis primaris i a la regió perinuclear) i la Tyr-tubulina en els més dinàmics. El 2016, es va observar que si una Glu-tubulina que ja ha estat destirosinada perd el seu residu Glu-terminal es pot convertir en Δ2-tubullina.
A partir d'aquest moment la identificació de TCP es va convertir en l'objectiu principal de moltes investigacions arreu del món. Es volia entendre la funció fisiològica de la destirosinació de l'α-tubulina i les conseqüències de la seva inhibició. En alguns dels experiments per a estudiar els efectes i mecanismes de la seva inhibbició es va utilitzar un inhibidor de la vasohibina basat en residus de tirosina, epoY.
Identificació de VASH-1 i VASH-2 Tot això va permetre que, després de quatre dècades d'investigació, el 2017, gràcies a un projecte internacional de col·laboració en què participaven investigadors de la CEA (Comissió Francesa d'Energia Atòmica), el CNRS (Centre Nacional Francès d'Investigació Científica), Inserm (Institut Nacional Francès de Salut i Investigació Mèdica), la Universitat de Grenoble-Alpes, la Universitat de Montpeller i la Universitat Stanford, els químics dissenyessin una petita molècula que inhibia l'activitat de la TCP. Pensaven utilitzar-la com a esquer per tal d'atrapar l'enzim.
El resultat va ser la identificació de dos enzims, vasohibina-1 i vasohibina-2 (VASH1 i VASH2), que associats a la proteïna SVBP (small vasohibin binding protein), poden causar la destirosinació de l'α-tubulina. Aquests dos enzims, VASH1 i VASH2, ja es coneixien però no s'havien relacionat amb el citoesquelet.
S'espera a arribar a modular l'activitat dels complexos VASH1/SVBP i VAH2/SVBP i comprendre el paper de la tubulina, atès que les seves modificacions postraduccionals són uns dels factors que n'afecten les propietats. La desregulació del cicle destirosinació/tirosinació, s'ha relacionat amb càncers, malalties cardiovasculars i trastorns neuronals; millorar-ne el coneixement podria permetre desenvolupar nous tractaments més específics.
Localització Les tubulina-tirosina carboxipeptidases (TCP), siguin la VASH1 o la VASH2, són secretades per la cèl·lula. Es troben principalment al citosol, prop del citoesquelet. No obstant això, una gran part d'aquests enzims pot ser secretada per vies no canòniques (vies UPS: unconventional protein secretion). La interacció entre la TCP i la proteïna SVBP promou aquesta secreció. També estan associades als microtúbuls dins de la cèl·lula. Les dues vasohibines es troben en gran quantitat a les cèl·lules eucariotes i la VASH 1, més abundant que la 2, es troba de forma abundant al cor, cervell i ronyó.
Expressió Estat de desenvolupament: aquest tipus d'enzim s'expressa en diversos òrgans embrionaris de la sisena a la dotzena setmana de desenvolupament embrionari. A partir de la setmana 20 d'aquest període de desenvolupament, es pot detectar dins dels vasos dels òrgans embrionaris i dins de les cèl·lules endotelials de vasos més amples en el nounat.
Estructura +Principals característiquesProteïnaTubulina-tirosina Carboxipeptidasa 1 (VASH 1)Tubulina-tirosina Carboxipeptidasa 2 (VASH 2)Localització (UCSC)Chr 14: 76.761 – 76.783 Mb miniatura|El gen que codifica la proteïna VASH 1 es troba a regió 14q24.3 del cromosoma 14.|centerChr 1:21.295-21.299 Mb miniatura|El gen que codifica la VASH 2 es troba a la regió q32.3 del cromosoma 1.|centerLlargada cadena365 aminoàcids355 aminoàcidsPes molecular40957 Da40450 DaRepresentació 3Dminiatura|Esquema de l'estructura 3D de VASH1 enllaçada amb la proteïna SVBP.|centerminiatura|Esquema de l'estructura 3D de VASH2 enllaçada amb la proteïna SVBP.|centerCentres de separació (cleavage sites)29 - 30 76 - 77Centres actius (active sites)158 193
210 Estructura primària : té una cadena de 365 aminoàcids.
"MPGGKKVAGGGSSGATPTSAAATAPSGVRRLETSEGTSAQRDEEPEEEGEEDLRDGGVPFFVNRGGLPVDEATWERMWKHVAKIHPDGEKVAQRIRGATDLPKIPIPSVPTFQPSTPVPERLEAVQRYIRELQYNHTGTQFFEIKKSRPLTGLMDLAKEMTKEALPIKCLEAVILGIYLTNSMPTLERFPISFKTYFSGNYFRHIVLGVNFAGRYGALGMSRREDLMYKPPAFRTLSELVLDFEAAYGRCWHVLKKVKLGQSVSHDPHSVEQIEWKHSVLDVERLGRDDFRKELERHARDMRLKIGKGTGPPSPTKDRKKDVSSPQRAQSSPHRRNSRSERRPSGDKKTSEPKAMPDLNGYQIRV"
: té una cadena de 355 aminoàcids.
"MTGSAADTHRCPHPKGAKGTRSRSSHARPVSLATSGGSEEEDKDGGVLFHVNKSGFPIDSHTWERMWMHVAKVHPKGGEMVGAIRNAAFLAKPSIPQVPNYRLSMTIPDWLQAIQNYMKTLQYNHTGTQFFEIRKMRPLSGLMETAKEMTRESLPIKCLEAVILGIYLTNGQPSIERFPISFKTYFSGNYFHHVVLGIYCNGRYGSLGMSRRAELMDKPLTFRTLSDLIFDFEDSYKKYLHTVKKVKIGLYVPHEPHSFQPIEWKQLVLNVSKMLRADIRKELEKYARDMRMKILKPASAHSPTQVRSRGKSLSPRRRQASPPRRLGRREKSPALPEKKVADLSTLNEVGYQIRI"
VASH2 té una homologia del 52.5% de la seqüència d'aminoàcids si es compara amb la de VASH1.
Estructura secundària L'estructura secundària correspon a l'estructura tridimensional regular de segments locals. Existeixen majoritàriament dues estructures molt estables a les proteïnes: hèlix α i full o làmina β. Es troben aquestes mateixes estructures en les tubulina-tirosina carboxipeptidases.
En la tubulina-tirosina carboxipeptidasa 1, hi ha 8 hèlixs α, 10 fulls β i un gir (veure figura 1).
En la tubulina-tirosina carboxipeptidasa 2, hi ha 8 hèlixs α, 8 fulls β i un gir (veure figura 2). miniatura|Estructura secundària Tubulinyl-Tyr Carboxipeptidasa 2miniatura|Estructura secundària Tubulinyl-Tyr Carboxipeptidasa 1 Estructura terciària i quaternària Els enzims TCP que es coneixen fins ara tenen l'estructura d'un complex heterodímer estable entre VASH 1 o VASH 2 i SVBP (small vasohibin-binding protein). Per a dur a terme els estudis d'aquestes proteïnes es van examinar les estructures completes de VASH 1 i VASH 2 humanes a partir del mètode de cristal·lització. També es va estudiar l'estructura del que es va preveure que era el domini principal de cadascun dels enzims (V1c i V2c). Aquests estudis van demostrar que els aminoàcids visibles en les formes completes i en V1c i V2c tenien un alt grau de conservació estructural. També es van fer estudis experimentals amb cèl·lules HEK293T que van demostrar que l'activitat enzimàtica de V2c–SVBP i V2–SVBP era molt semblant i que, per tant, les regions no incloses en l'estructura V2c eren poc importans per a la funció de l'enzim. A causa d'aquestes semblances entre VASH 1, VASH 2 i V2c–SVBP, els experiments posteriors es van fer únicament amb el complex V2c–SVBP.
Interacció VASH 2 i SVBP L'enzim VASH 2 té una estructura composta per dos dominis, el C-terminal i el N-terminal. El domini N-terminal és helicoidal i envolta l'hèlix C-terminal del SVBP. El domini C-terminal de VASH 2 està conformat per una làmina beta antiparal·lela al centre amb dos subdominis helicoidals als costats, on es troba el residu catalític de cisteïna. Els dominis C i N-terminal s'empaqueten mitjançant el SVBP, que es troba entre els dos dominis. Entre els dominis C i N-terminal de VASH 2 i SVBP es donen interaccions hidrofòbiques i enllaços d'hidrogen, que estabilitzen la interacció.
Interacció complex VASH 2-SVBP i l'α-tubulina El centre actiu o zona activa de VASH 2 és una zona de la proteïna que està carregada positivament i interacciona amb la cadena C-terminal de l'α-tubulina, carregada negativament. El centre actiu està format pels residus d'aminoàcids K157, R211, Y123, C158, S210, L215, H193 i K135. Aquests aminoàcids són claus per a la funció de destirosinació de l'α-tubulina, però la tríada de residus catalítics la formen els aminoàcids C158, H193 i L215. Els aminoàcids de l'α-tubulina que formen enllaços amb VASH 2 són els més propers a l'extrem C-terminal: Y451, C450, E449, G448 i E447. Entre els aminoàcids de l'enzim i el substrat es donen els enllaços següents: pont salí i/o pont d'hidrogen. També es dona un enllaç disulfur en el residu catalític C158 amb l'α-tubulina.