miniatura|Estructura tridimensional del complex de flotil·lines en la membrana resolta amb crio-microscòpia electrònica (Cryo-EM). Els colors verd i taronja representen les subunitats del compolex protèic. La flotil·lina - també anomenada reggie - és una proteïna estructural present als microdominis funcionals de membrana plasmàtica, específicament a les basses lipídiques (lipid rafts), que participa en processos de trànsit de membranes i senyalització cel·lular.
Per altra banda, la flotil·lina és considerada una proteïna bastida (scaffold protein). Situades a la membrana, recluten les proteïnes que han de situar-se als llocs concrets de les membranes, les activen i les afavoreixen a interaccionar amb el seu entorn i a la seva oligomerització.
Estructura L'organització complexa de la flotil·lina ha pogut ser descrita amb detall especialment gràcies a la resolució estructural mitjançant la tècnica de crio-microscòpia electrònica (cryo-EM).
Les flotil·lines són proteïnes pertanyents a la superfamília de proteïnes SPFH (Stomatin, Prohibitin, Flotillin i HflC/K) o dominis PHB. Estan associades a la membrana més específicament ancorades a la monocapa citosòlica de la membrana plasmàtica i a les endomembranes. S'expressen de manera ubiqua i es descriuen com a proteïnes bastida (scaffolding proteins).
En mamífers s’expressen dues formes principals: Flotil·lina-1 (Reggie-2) i Flotil·lina-2 (Reggie-1). Ambdues tenen una identitat d’aminoàcids d’entre el 50 i el 69%. Cada flotil·lina està formada per aproximadament 400 aminoàcids (Flotil·lina-1: 1–422 aa; Flotil·lina-2: 1–402 aa), amb una massa molecular d’uns 47–49 kDa per monòmer. El complex complet de flotil·lines pot arribar a contenir 44 subunitats (22 Flo-1 i 22 Flo-2), amb una massa total superior als 2 MDa. miniatura|La flotil·lina, amb la part hidrofòbica ancorada a membrana citosòlica, presenta un domini N-terminal SPFH que inclou un domini CRAC (1) responsable de la unió al colesterol, seguit d’un domini flotil·lina C-terminal amb estructures coiled-coil (CC1 i CC2).
Arquitectura estructural El Domini N-terminal (SPFH) comença diversos aminoàcids avall de l'extrem N-terminal i comprèn uns 180 aminoàcids. Ocupa aproximadament els aminoàcids 3–185 per a Flotil·lina-1 i 8–188 per a Flotil·lina-2. Conté una regió d’hèlix hèlix α essencial per a la oligomerització de tetràmers. També inclou motius CRAC (Cholesterol Recognition/interaction Amino acid Consensus) responsables de la unió al colesterol (en Flo-1 es troba en els residus 117–124 i en Flo-2: es presenta en els residus 120–127 i 157–169). Aquest domini actua com a marcador de basses lipídiques, participant en la interacció amb lípids com l'esfingosina i el colesterol. El domini N-terminal conté diversos motius addicionals d'unió a lípids i proteïnes, d’entre els quals destaca el motiu d’unió a PDZ3 (PDZ3-binding domain).
D'altra banda, el domini de flotil·lina és adjacent al domini SPFH i de mida similar. Aquest domini conté fragments rics en repeticions GluAla que es fa que formin estructures de coiled-coil (CC1 i CC2). Aquests fragments d'hèlix α del domini flotil·lina realitzen interaccions amb altres proteïnes i són crucials per a l'oligomerització de la flotil·lina-2.
Modificacions post-traduccionals Les modificacions químiques són clau per a la unió de les flotil·lines a la membrana i per la seva funcionalitat:
S-Palmitoilació: modificació reversible que consisteix en la unió de la cadena acil palmitoil saturada a un residu de cisteïna mitjançant un enllaç tioèster. N-Miristoilació: modificació irreversible majoritàriament co-traduccional que permet una unió inicialment feble a la membrana facilitant així la S-palmitoilació. La Flotil·lina-1 no pot fer aquest ancoratge. Fosforilació de serina: ancoratge de la flotil·lina a la membrana plasmatica. En mamífers, la tirosina quinasa Fyn internalitza els microdominis de flotidil·lina i redistribueix la Flotil·lina-1 i la Flotil·lina-2 des de la membrana plasmàtica cap als endosomes tardans i els lisosomes. Sumoilació: indueix la translocació al nucli per regular l’expressió gènica. La Flotil·lina-2 no pot fer aquest ancoratge.
Organització supramolecular S’ha demostrat que les flotil·lines no travessen completament la membrana, sino que s’hi insereixen parcialment. Aquest fenomen és causat pel seu caràcter amfipàtic, és a dir, presenta regions hidrofòbiques inserides a la monocapa citosòlica i regions hidrofíliques que interaccionen amb el citoplasma. Presenten una regió hidrofòbica a la part N-terminal de 35–40 aminoàcids i una segona seqüència hidrofòbica a la part mitjana del domini SPFH en els aminoàcids 134–150/151 en flotil·lines humanes.
L'oligomerització, juntament amb les modificacions post-traduccionals d'acilació, és un factor important per l'ancoratge de les flotillines a la membrana. Aquestes proteïnes són una barreja de monòmers, homodímers i heterotetràmers. Concretament, l'oligomerització de la Flotil·lina-2 és regulada per fragments del domini flotil·lina rics en repeticions GluAla. miniatura|Imatge lateral 3D de l'estructura del complex de flotil·lines en forma una gàbia amb un extrem ample i un extrem estret. El complex de flotil·lines forma una gàbia amb un extrem ample (rim) de 32 nm de diàmetre, unit a la superfície de la membrana, i un extrem estret (narrow end) de 19 nm de diàmetre. La paret de la gàbia està composta per un barril d'hèlixs α amb 44 hèlixs que provenen dels aminoàcids C-terminals del domini flotil·lina. L'estructura rígida de la gàbia altera la curvatura de la membrana adjacent.
Funcions Les funcions de la flotil·lina inclouen la regulació de senyalització cel·lular mitjançants l’estabilització de microdominis funcionals de membrana, vies endocítiques, processos de divisió cel·lular i mitosi i la mobilitat cel·lular.
Regulació de senyalització cel·lular per la mobilitat miniatura|De dalt a baix: membrana plasmàtica, flotil·lina, vinexina, vinculina i filament d'actina.
Tant la flotil·lina-1 (reggie-2) com la flotil·lina-2 (reggie-1) s’agrupen en hetero-oligòmers a la cara citosòlica de la membrana plasmàtica mitjançant aciclació. Tanmateix també acostumen a formar microdominis rics en colesterol i esfingolípids a les membranes d’orgànuls intercel·lulars com els endosomes, l’aparell de Golgi, el reticle endoplasmàtic, vesícules extracel·lulars i, esporàdicament, al nucli.
Degut a la topologia de les flotil·lines, recau en elles el rol de formar plataformes atraient a la superfície de les membranes molècules de senyalització per tal de millorar l’efectivitat de les vies de transudcció de senyals en que participen. La categoria en que són classificades les flotil·lines per la realització d’aquesta funció és la de proteïnes d’andamiatge o de bastida (scaffolding proteins, en anglès).
Les evidències presentades pels estudis de Munderloh C et al sobre la participació de la flotil·lina en la regeneració dels axons als nervis òptics del peix zebra, van obligar la comunitat científica a plantejar la participació d’aquestes proteïnes en la regulació de la dinàmica del citoesquelet. Primerament, va constatar-se que la sobreexpressió de flotil·lina contribueix a la formació de filopodia, i, posteriorment va associar-se la flotil·lina amb el domini SoHo (sorbin homology domain) a l’extrem N-terminal de la família protèica de les vinexines (complex CAP, vinexina i ArgBP2). Aquesta relació és transcendent en tant que a l’extrem C-terminal, la família de les vinexines posseeix tres dominis SH3 amb tendència a unir-se a nombroses proteïnes entre les quals es destaquen la vinculina, la afadina i petits receptors de GTPases, reguladores de la dinàmica del citoesquelet. Per tant, les flotil·lines tenen funció d’andamiatge en la regulació del citoesquelet i, per tant, participen en la motilitat de la cèl·lula.
Regulació de senyalització cel·lular en vies concretes A més a més, Bauman et al demostraren que l’actuació de la flotil·lina com a andami en la recaptació del complex de tirosina Cbl fosforilada i la proteïna associada a la Cbl, mencionada prèviament amb el nom de complex CAP, és crucial per la translocació de la proteïna transportadora de glucosa GLUT4. És a dir, amb estimulació via insulina va veure’s com s’activava la captació del complex CAP per part de les flotil·lines inserides a les balses lipídiques. En el complex CAP, es produeix una fosforil·lació en aquesta topologia concreta i això desencadena una cascada de reaccions que desemboca en l’activació de petites GTPases TC10, que, al seu torn, provoquen la translocació de la proteïna GLUT4 de compartiments intercel·lulars a la superfície de la cel·lula on les flotil·lines es troben.
miniatura|Pol·larització del limfòcit T en resposta a un estímul al receptor d'antigen, degut a l'activació de la cascada de transducció de senyals medida per la flotil·lina
En les cèl·lules T, la flotil·lina també efectua el seu rol de proteïna d’andamiatge formadora de plataformes. Les reggies es concentren en microdominis de la membrana dels limfòcits i agrupen proteïnes necessàries per la resposta immunitària del limfòcit al voltant del receptor d’antígens T quan aquest ha estat estimulat. D’aquesta manera pot dir-se que pol·laritzen la cèl·lula tot creant un macrodomini a l’àrea on es formarà la sinapsi immunològica. Aquesta pol·larització funcional és típica en l’activació dels limfòcits T, i la flotil·lina n’és la responsable. Concretament, la proteïna SPFH és fosforil·lada per les cinases de la família Src, que al seu torn han estat activades per l’estimulació del receptor d’antígens T, i amb això atrauen molècules vàries (Lck, Fyn, LAT…) involucrades en l’efectivitat de la sinapsi immunològica.
Malgrat haver estat descobertes fa més d’una dècada, no totes les vies de transducció de senyals en què participa la flotil·lina han estat estudiades amb detall, però en general, algunes de les tècniques més emprades en la seva investigació són la microscopia de fluorescència, la preparació de detergents resistents a membranes i la immunoprecipitació.
Vies endocítiques miniatura|Internalització d'una vesícula amb una proteïna ancorada a GPI formada per la participació de les flotil·lines
Múltiples estudis han demostrat que la flotilina participa en vies endocítiques independents de clatrina i caveoles. Inicialment, aquesta funció va descobrir-se en l’endocitosi de proteïnes ancorades a GPI CD59 i en la del receptor de la toxina de la còlera, el glicoesfingolípid GM1 per Frick et al. Les evidències científiques que proven l’involucrament de les reggie en l’endocitosi d’aquestes proteïnes en específic es basen en l’inhibició de les flotil·lines junt amb la de les dinamines amb l’obtenció d’una manca clara d’internalització de CD59 i del receptor. Altres demostracions que provaren aquesta funció foren la detecció de flotil·lines properes a cargo recentment internalitzat per invaginacions, estudiades per Glebov et al mitjançant microscopia interna de reflexió total i microscopia immunoelectrònica.
En adició a l’endocitosi de proteïnes associades a GPI i el receptor de la toxina de la colèra, les reggie participen en el processament i maduració de la proteïna de senyalització pertanyent a la família dels factors de creixement nodal. El mecanisme d’acció per a fer-ho es basa en la unió de la proteïna cripto, associada a GPI, amb la flotil·lina a la vegada que amb la nodal. D’aquesta manera s’endocitaria el complex cripto-nodal per l’efecte de la flotil·lina.
Per acabar, l’article de Payne et al descriuria com les flotil·lines participen en la internalització dels heparan sulfat proteoglicans, necessaris en la matriu extracel·lular per a permetre l’entrada de molècules carregades positivament de naturalesa lipídica o peptídica.
En definitiva, les flotil·lines permeten l’endocitosi independent de clatrina i caveoles de moltes espècies que han de ser translocades per al compliment de les seves respectives funcions.