miniatura|Imatge generada per ordinador d'un model de l'estructura tridimensional de l'enzim bacterià purina nucleòsid fosforilasa. La cinètica enzimàtica estudia la velocitat de les reaccions químiques que són catalitzades pels enzims. L'estudi de la cinètica d'un enzim permetrà elucidar els detalls del seu mecanisme catalític, el seu paper en el metabolisme, com es controla la seva activitat en la cèl·lula i com pot ser inhibida la seva activitat amb fàrmacs o verins o potenciada per altre tipus de molècules.
Els enzims són macromolècules amb la capacitat de manipular altres molècules, denominades substrats. Un substrat és capaç d'unir-se al centre catalític de l'enzim que el reconegui i transformar-se en un producte al llarg d'una sèrie de passos denominats mecanisme enzimàtic. Alguns enzims poden unir diversos substrats diferents i/o alliberar diversos productes, com és el cas de les proteases al trencar una proteïna en dos polipèptids. En altres casos, es produeix la unió simultània de dos substrats, com en el cas de l'ADN-polimerasa, que és capaç d'incorporar un nucleòtid (substrat 1) a una cadena d'ADN (substrat 2). Encara que tots aquests mecanismes solen seguir una complexa sèrie de passos, també solen presentar una etapa limitant que determina la velocitat final de tota la reacció. Aquesta etapa limitant pot consistir en una reacció química o en un canvi conformacional de l'enzim o del substrat.
El coneixement adquirit sobre l'estructura dels enzims ha estat de gran ajuda en la visualització i interpretació de les dades cinètiques. Per exemple, l'estructura pot suggerir com romanen units substrat i producte durant la catàlisi, quins canvis conformacionals ocorren durant la reacció, o fins i tot el paper en particular de determinats aminoàcids en el mecanisme catalític. Alguns enzims modifiquen la seva conformació significativament durant la reacció, en aquest cas, pot ser crucial saber l'estructura molecular de l'enzim amb substrat unit i sense (se solen usar anàlegs que s'uneixen però no permeten portar a terme la reacció i mantenen a l'enzim permanentment en la conformació de substrat unit).
Els mecanismes enzimàtics poden ser dividits en mecanisme d'únic substrat o mecanisme de múltiples substrats. Els estudis cinètics portats a terme en enzims que solament uneixen un substrat, com la triosa fosfat isomerasa, pretenen amidar l'afinitat amb la qual s'uneix el substrat i la velocitat amb la qual el transforma en producte. D'altra banda, quan s'estudia un enzim que uneix diversos substrats, com la dihidrofolat reductasa, la cinètica enzimàtica pot mostrar també l'ordre en el qual s'uneixen els substrats i l'ordre en el qual els productes són alliberats.
No obstant això, no totes les catàlisis biològiques són portades a terme per enzims proteics. Existeixen molècules catalítiques basades en l'ARN, com els ribozims i els ribosomes, essencials per a l'empalmament alternatiu i la traducció de l'ARNm, respectivament. La principal diferència entre els ribozims i els ribosomes radica en el limitat nombre de reaccions que poden portar a terme els primers, encara que els seus mecanismes de reacció i les seves cinètiques poden ser estudiades i classificades pels mateixos mètodes.
Principis generals miniatura|La velocitat de la reacció va augmentant a mesura que augmenta la concentració de substrat fins que l'enzim se satura. La reacció catalitzada per un enzim utilitza la mateixa quantitat de substrat i genera la mateixa quantitat de producte que una reacció no catalitzada. Igual que ocorre en altres tipus de catàlisis, els enzims no alteren en absolut l'equilibri de la reacció entre substrat i producte.Ebbing, D.D. General chemistry (4th edition) Houghton Mifflin Co. 1993, No obstant això, al contrari que les reaccions químiques, els enzims se saturen. Això significa que a major quantitat de substrat, major nombre de centres catalítics estaran ocupats, el que incrementarà l'eficiència de la reacció, fins al moment que tots els llocs possibles estiguin ocupats. En aquest moment s'haurà arribat al punt de saturació de l'enzim i, encara que s'afegeixi més substrat, no augmentarà més l'eficiència.
Les dues propietats cinètiques més importants d'un enzim són: el temps que triga a saturar-se amb un substrat en particular i el seu punt màxim de saturació. El coneixement d'aquestes propietats fa possible hipotetitzar sobre comportament d'un enzim en l'ambient cel·lular i predir com respondrà enfront d'un canvi d'aquestes condicions.
Assajos enzimàtics miniatura|Corba de saturació d'una reacció enzimática. El pendent representa, en el període inicial, la velocitat de la reacció. L'equació de Michaelis-Menten descriu com va variant el pendent amb la concentració de substrat o d'enzim. Un assaig enzimàtic és un procediment, portat a terme en un laboratori, mitjançant el qual es pot amidar la velocitat d'una reacció enzimàtica. Com que els enzims no es consumeixen en la reacció que catalitzen, els assajos enzimàtics solen amidar els canvis experimentats bé en la concentració de substrat (que va decreixent) o bé en la concentració de producte (que va augmentant). Existeixen diversos mètodes per a realitzar aquestes mesures. L'espectrofotometria permet detectar canvis en l'absorbància de llum per part del substrat o del producte (segons la concentració d'aquests) i la radiometria implica incorporació o alliberament de radioactivitat per a amidar la quantitat de producte obtingut per temps. Els assajos espectrofotomètrics són els més utilitzats, ja que permeten amidar la velocitat de la reacció de forma contínua. Per contra, els assajos radiomètrics requereixen retirar les mostres per a amidar-les, pel que són assajos discontinus. No obstant això, aquests assajos són extremadament sensibles i permeten detectar nivells molt baixos d'activitat enzimàtica.Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) També es pot utilitzar l'espectrometria de masses per a detectar la incorporació o alliberament d'isòtops estables quan el substrat és convertit en producte.
Els assajos enzimàtics més sensibles utilitzen làsers dirigits a través d'un microscopi per a observar els canvis produïts en enzims individuals quan catalitzen una reacció. Aquestes mesures poden utilitzar canvis produïts en la fluorescència de cofactors que intervenen en el mecanisme de catàlisi o bé unir molècules fluorescents en llocs específics de l'enzim, que permetin detectar moviments ocorreguts durant la catàlisi.Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. Aquests estudis estan donant una nova visió de la cinètica i la dinàmica de les molècules individuals, en oposició als estudis de cinètica enzimàtica tradicionals, en els quals s'observa i s'amida el comportament d'una població de milions de molècules d'enzim.
En la figura de la dreta es pot observar la típica evolució d'una corba obtinguda en un assaig enzimàtic. Inicialment, l'enzim transforma el substrat en producte seguint un comportament lineal. A mesura que avança la reacció, es va esgotant la quantitat de substrat i va disminuint la quantitat de producte que es genera per unitat de temps (disminueix la velocitat de la reacció), el que es manifesta en forma de corba asimptòtica en la gràfica. Depenent de les condicions de l'assaig i del tipus d'enzim, el període inicial pot durar des de mil·lisegons fins a hores. Els assajos enzimàtics solen estar estandarditzats perquè el període inicial duri entorn d'un minut, per a portar a terme les mesures més fàcilment. No obstant això, els moderns equips de barreja ràpida de líquids permeten portar a terme mesures cinètiques de períodes inicials la durada dels quals pot arribar a ser inferior a un segon.Gibson Q.H. Rapid mixing: Stopped flow Methods in Enzymology, (1969) 16:187-228 Aquest tipus d'assajos ràpids són essencials per a mesures de la cinètica de l'estat estacionari, discutida més baix.
La majoria dels estudis de cinètica enzimàtica se centren en el període inicial, és a dir, en la zona lineal de la reacció enzimàtica. No obstant això, també és possible amidar tota la corba de la reacció i ajustar aquestes dades a una equació no lineal. Aquesta forma d'amidar les reaccions enzimàtiques es denomina anàlisis de la corba de progrés.Duggleby, R.G. Analysis of enzyme progress curves by non-linear regression. Methods in Enzymology, (1995) 249:61-90. Aquesta aproximació és molt útil com a alternativa a les cinètiques ràpides, quan el període inicial és massa ràpid per a ser amidat amb precisió.
Factors físic-químics que poden modificar l'activitat enzimàtica Temperatura: els enzims són sensibles a la temperatura i la seva activitat pot veure's modificada per aquest factor. Els intervals de temperatures òptimes poden arribar a variar substancialment d'uns enzims a uns altres. Normalment, a mesura que augmenta la temperatura, un enzim veurà incrementada la seva activitat fins al moment que comenci la desnaturalització d'aquesta, que donarà lloc a una reducció progressiva d'aquesta activitat. pH: l'interval de pH òptim també és molt variable entre diferents enzims. Si el pH del medi s'allunya de l'òptim de l'enzim, aquesta veurà modificada la seva càrrega elèctrica a l'acceptar o donar protons, el que modificarà l'estructura dels aminoàcids i, per tant, l'activitat enzimàtica. Concentració salina: igual que en els casos anteriorment esmentats, la concentració de sals del mitjà és crucial per a una òptima activitat enzimàtica. Una elevada concentració o una absència de sals en el mitjà poden impedir l'activitat enzimàtica, ja que els enzims requereixen una adequada concentració de ions per a mantenir la seva càrrega i la seva estructura.
Reaccions amb un substrat Els enzims que presenten un mecanisme d'únic substrat inclouen isomerases, com ara la triosa fosfat isomerasa o la bisfosfoglicerat mutasa, i liases intramoleculars, com ara l'adenilat ciclasa o la ribozim ARN-liasa.Hammann C, Lilley DM. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem. 2002 Aug 2;3(8):690-700. No obstant això, existeixen certes reaccions enzimàtiques d'únic substrat que no pertanyen a aquesta categoria de mecanismes, com és el cas de la reacció catalitzada per la catalasa. La catalasa reacciona inicialment amb una molècula de peròxid d'hidrogen (aigua oxigenada) i queda en un estat oxidat després d'alliberar el producte (aigua), i, posteriorment, és reduïda per una segona molècula de substrat. Encara que durant la reacció solament participa un substrat, l'existència d'un intermediari enzimàtic modificat permet incloure al mecanisme de la catalasa en la categoria de mecanismes de ping-pong, un tipus de mecanisme discutit més endavant.
Cinètica de Michaelis-Menten
Com que les reaccions catalitzades per enzims són saturables, la velocitat de catàlisi no mostra un comportament lineal en una gràfica a l'augmentar la concentració de substrat. Si la velocitat inicial de la reacció s'amida a una determinada concentració de substrat (representat com a [S]), la velocitat de la reacció (representat com a V) augmenta linealment amb l'augment de la [S], com es pot veure en la figura. No obstant això, quan s'augmenta la [S], l'enzim se satura de substrat i arriba a la seva velocitat màxima (Vmax), que no sobrepassarà en cap cas, independentment de la [S].
miniatura|esquerra|Mecanisme d'unió d'únic substrat per a una reacció enzimàtica. k1, k-1 i k₂ són les constants cinètiques per a cadascuna de les etapes de la reacció.