siRNA son las siglas en inglés de small interfering RNA, en español ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o ARN de silenciamiento, una clase de ARN bicatenario.
Es un tipo de ARN interferente con una longitud de 20 a 25 nucleótidos que es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su ARN mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo. Interviene en el mecanismo denominado interferencia de ARN (RNA interference, RNAi), donde el siRNA interfiere con la expresión de un gen específico, reduciéndola. Además, los siRNAs también actúan en otras rutas relacionadas con el RNAi, como en la defensa antiviral o en la organización de la estructura de la cromatina en un genoma. La complejidad de estas rutas es el objeto de intensos estudios, y su descubrimiento fue la razón por la cual Craig C. Mello y Andrew Fire recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2006.
thumb|150px|Proteína DICER de Giardia intestinalis.
Definición y modo de funcionamiento Los siRNAs son moléculas de ARN doble hebra de 20-25 nucleótidos (nt) perfectamente complementarias, que se originan a partir de un ARN largo de doble hebra (dsRNA, double strand RNA). Los dsRNAs pueden ser de origen endógeno (por ejemplo los tránscritos generados a partir de secuencias de ADN repetidas en tándem), o de origen exógeno (como virus o transgenes). La enzima responsable del procesamiento del dsRNA en moléculas de siRNAs es Dicer, una enzima citoplásmica de la familia ARNasa III, que procesa el dsRNA en fragmentos de ARN doble hebra con extremos 5' fosfato y 2 nucleótidos libres con extremo hidroxilo (-OH) en 3'.
Los siRNAs suprimen la expresión de los genes diana mediante el corte del ARN mensajero (ARNm) complementario en dos mitades, a través de la interacción de la hebra antisentido del siRNA con el complejo RISC (RNA-induced silencing complex). Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinaria celular, lo que conlleva la supresión de la expresión del gen.
Por otro lado, los siRNAs promueven la modificación del ADN, facilitando el silenciamiento de la cromatina, puesto que favorecen la expansión de los segmentos de heterocromatina, a través del complejo RITS (RNA-induced transcriptional silencing).
Descubrimiento
PTGS en plantas thumb|250px|right|Ejemplo de plantas de petunia en las que los genes responsables de la pigmentación han sido silenciados mediante RNAi. La planta de la izquierda es de tipo salvaje (no modificada); las de la derecha expresan un transgén (gen introducido artificialmente) que induce la supresión de la expresión del transgén y el gen endógeno, produciendo áreas blancas no pigmentadas en la flor. El mecanismo de interferencia de ARN (RNAi) se observó por primera vez en plantas como parte del silenciamiento post-transcripcional de genes (PTGS). Investigadores que trataban de introducir transgenes en petunias para conseguir flores de un color violeta más intenso, obtuvieron flores con zonas blancas, lo que indicaba que tanto los transgenes introducidos como los genes endógenos habían sido silenciados.Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 1990 Apr;2(4):279-289 Este efecto se denominó co-supresión, y se observó que podía inducirse por: la expresión de un transgén en altos niveles transgenes que se expresan en niveles menores, pero que se integran en el genoma de la planta en copias múltiples por secuencias homólogas a un gen endógeno que se han introducido mediante un virus
Por esta razón, se supuso que este era un mecanismo de defensa en las plantas, de forma que estas responden a la infección de los retrovirus mediante la destrucción de los ARN virales. Sin embargo, el mecanismo de acción era desconocido.
La tecnología anti-sense en gusanos thumb|right|250px|Un gusano adulto C. elegans, que ha crecido bajo supresión mediante RNAi de un receptor hormonal nuclear implicado en la regulación de la enzima desaturasa. Estos gusanos tienen un metabolismo de ácidos grasos anormal, pero son viables y fértiles. Por otro lado, los investigadores que trabajaban en la década de los 90 en el gusano C. elegans, inyectaban ARN-antisense en las gónadas del gusano para tratar de interferir con la expresión de los genes, puesto que pensaban que el ARN-antisense se aparearía con el ARNm (sense), evitando de esta forma la traducción del ARNm y suprimiendo la expresión del gen objetivo. Sin embargo, Guo y Kemphues, observaron que la inyección de ARN-sense en el gusano era igualmente eficaz que el ARN-antisense para la supresión de la expresión génica. Pero no podían explicar por qué razón.
En 1998, Andrew Fire, Craig C. Mello y colaboradores publicaron un trabajo en Nature, en el cual indicaban que, si inyectaban solo ARN de hebra simple en el gusano, tanto sense como antisense, no se observaba ningún efecto. Sin embargo, si inyectaban ARN doble hebra (dsRNA), observaban la supresión específica del gen objetivo. Esto puede parecer contradictorio con los resultados de Guo y Kemphues, pero estos inyectaron ARN de hebra simple (sense o antisense) que no había sido purificado, de forma que en el proceso de producción se producen segmentos de doble hebra, que son los que generan la supresión observada por Guo y Kemphues. Sin embargo, Fire y Mello utilizaron ARN purificado, que no contiene dsRNA y por tanto es inactivo. Cuando las hebras sense y antisense se aparean para producir dsRNA, el efecto de supresión es 100 veces mayor al observado con las hebras simples por separado.
Asimismo, en el mismo reporte, Fire y Mello establecieron que la interferencia de la expresión del gen objetivo se produce a nivel del ARNm: cuando inyectaron en gusanos dsRNA contra el gen mex-3, detectaron que el ARNm de mex-3 desaparece, y por tanto los gusanos no son viables. Sin embargo, cuando inyectaban ARN de hebra simple (sense o antisense) contra mex-3, la mayor parte del ARNm de mex-3 permanecía intacto, y por ello no se observa fenotipo.
Igualmente, también establecieron que el efecto de supresión solo ocurre si el dsRNA que se introduce en el gusano es complementaria de una región codificante (exones), pero no si es complementaria de una región no codificante (intrones o el promotor). Esto indica que la interferencia se produce a nivel del ARNm, cuando ya se han eliminado los intrones del pre-ARNm, y por tanto es un mecanismo post-transcripcional.
Inicialmente los dsRNAs se inyectaban en las gónadas de los gusanos, pero también pueden ser inyectados en el intestino o en la cabeza. Incluso se observa efecto cuando los gusanos son alimentados con cepas de E. coli portadoras de un plásmido a partir del cual se transcribe el dsRNA. En este caso el efecto es un poco más débil, pero todavía evidente. En todos los casos el efecto sobre la expresión del gen diana se observa no solo en el tejido inyectado, sino en la mayoría de los tejidos, lo que indica que la señal puede transmitirse de una célula a otra.
Prueba de la existencia de los siRNAs Una vez que estuvo claro que el mecanismo de RNAi actúa directamente sobre el ARNm, permanecía una importante cuestión: ¿qué es lo que causaba la degradación del ARNm? Los experimentos descritos a continuación explican cómo se descubrieron los siRNAs.
Para explicar la co-supresión observada en plantas, se propuso la existencia de ARNs anti-sense, que mediante apareamiento de bases con el ARNm diana, de alguna manera promoverían la degradación del ARNm o interferirían con la traducción del mismo. Sin embargo, en las células afectadas no se detectaron ARNs anti-sense que tuvieran el tamaño de los ARNm, de manera que los investigadores analizaron si en las plantas transgénicas afectadas aparecían moléculas de ARN de menor tamaño.
En uno de estos experimentos, realizado por Hamilton y Baulcombe en 1999, se analizó la presencia de pequeños ARNs en cinco líneas de plantas de tomate, que habían sido transformadas con un plásmido que codificaba para ACO (aminocyclopropane-carboxylate oxidase). En dos de las líneas analizadas la expresión del ARNm de ACO había sido suprimida, y consecuentemente el ARNm no se detectaba en Northern blots. Para detectar la posible presencia de ARN pequeños se utilizaron geles de Northern blot con mayor concentración de poliacrilamida, utilizando como sonda tránscritos sense o anti-sense. Sólo en las plantas en las que la expresión de ACO había sido suprimida se detectaron ARNs de aproximadamente 25 nt con ambas sondas, pero no se detectaron en las plantas en las que el ARNm de ACO estaba aún presente. Por tanto, se demostró la presencia de los pequeños ARN propuestos, en plantas en las que la expresión de ACO estaba afectada. Con experimentos similares se demostró que plantas infectadas con virus también contienen pequeños ARNs con secuencias virales.
Es importante notar que estos pequeños ARNs no son productos de la degradación del ARNm, porque se encontraron no sólo moléculas sense, sino también anti-sense.
thumb|right|250px|Un ejemplar adulto de la mosca Drosophila, un organismo modelo utilizado frecuentemente en experimentos de RNAi.
Para estudiar en más profundidad el mecanismo de RNAi, se utilizaron sistemas in vitro. En 2000, Phil Zamore, Tom Tuschl y colaboradores desarrollaron un sistema in vitro para estudiar embriones de Drosophila. El grupo de Greg Hannon desarrolló otro sistema in vitro, utilizando extractos de células de Drosophila en cultivo.
Zamore, Tuschl y colaboradores fueron los primeros en mostrar que el ARNm incubado en un extracto se degrada en presencia de dsRNA. Para ello, añadieron al extracto dos ARNm modelo que codifican para proteínas luciferasa de 2 especies diferentes (Drosophila no codifica la proteína luciferasa). Cuando se añadió al extracto dsRNA contra el ARNm de luciferasa, el ARNm fue degradado eficientemente. Cuando se añadió ARN antisense, sólo se degradó una pequeña cantidad del ARNm, y la adición de tampón únicamente (control negativo) no produjo ningún efecto. Estos resultados son similares a los obtenidos en los experimentos in vivo con C.elegans, donde se demostró que los dsRNAs son mucho más eficientes que el ARN antisense en la producción de un efecto de RNAi.
En otro experimento, Zamore, Tuschl y colaboradores comprobaron si los dsRNAs son procesados en pequeños fragmentos de ~25 nt (como ocurre en plantas). En este experimento, dsRNAs marcados radiactivamente bien en la hebra sense, en la antisense o en las dos, se incubaron en los extractos de Drosophila en presencia o ausencia de ARNm. Cuando los dsRNA se incubaron en el extracto, aparecieron fragmentos de 21 a 23 nts, independientemente de la presencia de ARNm, indicando que los pequeños ARNs proceden del dsRNA y no del ARNm. Este experimento mostraba además que ambas hebras del dsRNA (la sense y la antisense) se cortan en pequeños fragmentos, porque los fragmentos aparecen tanto cuando los dsRNAs han sido marcados solo en la hebra sense, como cuando has sido marcados sólo en la antisense. Este experimento muestra que los dsRNAs incubados en el extracto son procesados en pequeños fragmentos de ~21-22 nts. Este resultado es similar al resultado en plantas mencionado anteriormente.
Por tanto, la conclusión de los estudios precedentes es que fragmentos de dsRNA (introducidos en las plantas o añadidos a los extractos) son degradados en fragmentos de ~21-25 nts, que son capaces de reconocer el ARNm diana presente en la planta o en el extracto, induciendo a su vez la degradación de éste.
Los componentes del mecanismo de RNAi thumb|350px|right|La enzima Dicer corta ARN doble hebra y genera siRNAs o miRNAs. Estos ARN pequeños se incorporan en el complejo RISC (RNA-induced silencing complex), dirigiéndolo contra el ARNm complementario, y bien lo corta (siRNAs), bien inhibe su traducción (miRNAs).