thumb|Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante el uso de distintos cebadores.
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de la biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis. Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una sola copia de ese fragmento original, o molde.History of Polymerase Chain Reaction (PCR)
La técnica, para mayor comprensión del texto, se puede explicar en los pasos siguientes de una manera simple:
Juntar una única hebra sintética de ARN de solo veinte bases nitrogenadas. Separar las hebras de ADN a investigar y ver si la hebra sintética encaja en algún lugar de estas. Si lo hace: Se puede «animar» a la pequeña hebra sintética a que se reproduzca, proporcionándole más bases nitrogenadas, y las enzimas y condiciones apropiadas para hacer la tarea. Si se hace un número suficiente de veces, este fragmento se amplificará exponencialmente (a priori) desde una escala microscópica a una escala macroscópica. Después se produce otra corta hebra sintética con una secuencia de bases nitrogenadas diferentes y solo se repite el proceso. Al final se podrá leer todo el genoma haciendo varias PCR de muchos fragmentos de ADN diferentes (si es lo que se busca).
Con este procedimiento, resulta mucho más sencillo identificar, con una probabilidad muy alta, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, tanto en el campo forense como en los laboratorios, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha técnica.
Fundamento e importancia thumb|Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Actualmente existen algunos termocicladores que utilizan o pueden utilizar aceite mineral en el tubo de PCR como los termocicladores de nueva generación de flujo de aire.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y pruebas de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Reactivos thumb|Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 1 mL. Para realizar la técnica se necesitan:
Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores o iniciadores, oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a veintidós, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia (por la procesividad de la polimerasa). Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. Varios artículos en revistas revisadas por pares brindan recomendaciones sobre los procesos del diseño de cebadores (o primers, en inglés). Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes, como el potasio. Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq). ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.
Conceptos de la PCR
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positiva, pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos, ya que puede que una muestra sea negativa, pero sea dada como positiva porque se ha amplificado una región de ADN no diana o que no se buscaba amplificar.
Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
Ciclo de amplificación
thumb|300px|Esquema general de la PCR. thumb|300px|Grado de amplificación según el número de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto específico, 3: producto inespecífico); B concentración de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la concentración de ADN respecto del tiempo. El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (>90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.
Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opción de realizar la reacción de PCR con la llamada «tapa caliente». Es decir, el sistema del termociclador aplicará calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluían este sistema tenían que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensación de la muestra, ya que en el tubo de centrífuga (coloquialmente llamado "Eppendorf") se encuentran dos fases: líquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.
Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (o 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto solo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento () de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Alineamiento o unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) solo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada
Extensión o elongación de la cadena
Actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en (comúnmente ). El tiempo de extensión depende tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.
Elongación final