Le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par résonance de type Förster (en anglais, Förster resonance energy transfer ou FRET, resonance energy transfer ou RET ou electronic energy transfer ou EET), bien qu’observé par Perrin au début du , est décrit pour la première fois par Theodor Förster en 1946. Les applications de cette approche à l’étude des interactions protéiques apparaîtront vers la fin du Pour plus d'informations sur ces techniques : www.arpege.cnrs.fr, rubrique "Techniques".
vignette|Figure 1. Conditions du FRET. A. Un FRET peut apparaître seulement si le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’excitation de l’accepteur. Ce recouvrement est défini par une intégrale de recouvrement J. B. Un FRET est observé si la distance séparant les deux fluorophores est inférieure à 1.8 x le rayon de Förster ( ). Ce dernier définit la distance donneur – accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50 %. C. Importance de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur pour la mise en place d’un transfert d’énergie.
Conditions du transfert d’énergie D’après la théorie de Theodor Förster, le FRET est défini comme un transfert d’énergie non radiatif (sans émission de lumière) résultant d’une interaction dipôle – dipôle entre deux molécules (donneur et accepteur d’énergie). Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d’émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d’absorption de l’accepteur (Figure 1.A). Ce recouvrement des spectres est défini par une intégrale appelée intégrale de recouvrement J(λ) :
où est l’intensité de la fluorescence émise par le donneur à une longueur d’onde donnée et le coefficient d’extinction molaire de l’accepteur. Le facteur J reflète donc la capacité d’une paire de fluorophores à émettre et absorber de l’énergie à la même longueur d’onde.
En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur, comme le montre la formule suivante :
où R est la distance effective qui sépare les deux molécules et le rayon de Förster. Ce dernier correspond à la distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50 % (Figure 1.B). Cela signifie que lorsque la distance donneur-accepteur est égale au rayon de Förster, la probabilité pour que le donneur se désexcite par transfert d’énergie non radiatif sur l’accepteur est de 50 %. Cette probabilité de désexcitation augmente en faveur du transfert d’énergie lorsque la distance entre les fluorophores donneur et accepteur diminue. Les autres voies de désexcitation correspondent aux voies radiatives (fluorescence) et non radiatives (extinction par l’oxygène, quenching etc.). Le rayon de Förster dépend de la nature des fluorophores utilisés, et est généralement compris entre 1 et 10 nm. Au-delà de cette gamme, l’efficacité du transfert d’énergie chute très rapidement. L’expression mathématique pour le calcul de cette distance s’écrit :
où J est l’intégrale de recouvrement, n l’indice de réfraction du milieu ( est généralement compris entre 1/3 et 1/5), le rendement quantique du donneur en absence d’accepteur et le facteur d’orientation qui est fonction de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur (Figure 1.C). Même si la valeur de est théoriquement comprise entre 0 et 4, 2/3 est la valeur habituellement utilisée pour déterminer le R0. En effet, est assimilé à 2/3 lorsque le donneur et l’accepteur présentent un degré de liberté suffisant pour être aléatoirement orientés dans l’espace. Cette condition est généralement satisfaite pour les fluorophores attachés à des biomolécules car ils peuvent avoir une certaine liberté de rotation.
Caractéristiques photophysiques d'un fluorophore Une molécule capable d’émettre un signal de fluorescence est qualifiée de fluorophore. Différentes caractéristiques photophysiques permettent de le définir : les spectres d’excitation et d’émission. Ils représentent la signature de la structure énergétique du fluorophore. La différence de longueur d’onde séparant leur maximum s’appelle le déplacement de Stokes ; le coefficient d’extinction molaire (ε). Il correspond à la capacité d’absorption par le fluorophore de l’énergie apportée par un photon à une longueur d’onde donnée ; le rendement quantique (Φ). Il caractérise la capacité du fluorophore à re-émettre sous forme de lumière, l’énergie absorbée. Il est défini comme étant le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés ; la durée de vie de fluorescence (τ). Elle représente le temps de séjour moyen du fluorophore dans son état excité.
Comment mettre en évidence le FRET ? Le FRET mesure des intensités. Expérimentalement, ce signal peut être mesuré à l’aide d’un fluorimètre ou en microscopie. Dans un fluorimètre, le signal de FRET mesuré provient d'une population cellulaire disposée dans des puits de taille différente selon les microplaques utilisées. En revanche, les techniques microscopiques mesurent des évènements de transfert d’énergie à l’échelle subcellulaire. Quel que soit le type de détection choisi, la mesure d’un FRET entre deux fluorophores peut être effectuée de différentes manières.
La première consiste à quantifier les variations de l’intensité de fluorescence en mesurant la diminution de la fluorescence du donneur, l’augmentation de celle de l’accepteur ou en calculant un rapport que nous appellerons ratio (fluorescence d’émission de l’accepteur/fluorescence d’émission du donneur). Cette analyse est réalisable aussi bien en microplaque qu’en microscopie. La principale difficulté d’analyse de ces signaux vient du recouvrement pouvant exister entre les spectres d’excitation et d’émission des fluorophores utilisés. Ce manque de sélectivité spectrale est à l’origine d’un important bruit de fond avec comme conséquence une réduction de la sensibilité du test. Des couples de fluorophores tels que la fluorescéine/rhodamine ou les protéines CFP (Cyan fluorescent protein) / YFP (Yellow fluorescent protein) présentent ce type de limitation. Cependant, le signal sur bruit du FRET peut être amélioré en s’affranchissant d’une partie des signaux parasites grâce à une lecture en temps résolu. Ceci est possible en TR-FRET (Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer) grâce à l’utilisation de fluorophores à durée de vie longue tels que les chélates ou cryptates de terre rare (europium, terbium). À ce jour, le TR-FRET est appliqué uniquement dans des formats microplaques.
D'autres méthodes permettent de déterminer indirectement l’existence d’un FRET par photoblanchiment (pbFRET). Le photoblanchiment est une méthode qui consiste à éteindre un fluorophore par une exposition prolongée à une source lumineuse. La mise en œuvre de cette approche est préférable en microscopie confocale car il est ainsi possible d’obtenir une bonne résolution spatiale pour éteindre directement les fluorophores dans leur environnement cellulaire.
Dans le cas du FRET par photoblanchiment (pbFRET), le photoblanchiment du fluorophore donneur entraîne une diminution de son intensité de fluorescence qui est mesurée en présence ou non d’accepteur. Lorsque l’accepteur est en étroite proximité avec le donneur, un FRET apparaît et entre en compétition avec le processus de photoblanchiment. Cette compétition se traduit par une augmentation de la résistance du donneur au photoblanchiment dont les constantes de temps mesurées (en présence ou non d’accepteur) permettent de mettre en évidence un transfert d’énergie.
Une autre méthode par rapport au pbFRET du donneur est le pbFRET de l’accepteur aussi appelé DFRAP pour donor fluorescence recovery after acceptor photobleaching. Les émissions de fluorescence du donneur et de l’accepteur sont mesurées avant et après photoblanchiment de l’accepteur. L’augmentation de la fluorescence du donneur après destruction de l’accepteur est argument pour prouver l’existence d’un FRET entre les deux molécules. L’exemple de la figure 2 illustre ce principe. Dans cette expérience une protéine de fusion formée de deux protéines auto-marquantes, SNAP-tag et CLIP-tag (self-labeling protein tag), est exprimée à la surface de cellules HEK293T via un ancrage par une hélice alpha transmembranaire (Figure 2A).
vignette|300px|Figure 2. Retour de fluorescence du donneur d'énergie par photoblanchiment de l'accepteur :A. Principe.B. Spectres d'émission et d'absorption du donneur (AlexaFluor 488) et de l'accepteur (Cyanine 5).C. Images de cellules HEK293T (membranes plasmiques) obtenues en microscopie confocale (Zeiss LSM700). Rouge: Cy5, Vert: Alexa488. D. Variation de l'intensité de fluorescence du donneur et de l'accepteur au cours du photoblanchiment.
Ces protéines de 20 kDa, toutes deux dérivées de l’O-alkylguanine-DNA alkyltransferase humaine (AGT), sont respectivement marquées de manière spécifique avec des composés de type O-benzylguanine (BG) et O-benzylcytosine (BC) portant un fluorophore. La protéine SNAP-tag est marquée avec un dérivé BG-AlexaFluor 488 (Alexa488) et la protéine CLIP-tag avec un dérivé BC-Cyanine 5 (Cy5) (Figure 2A). La forte proximité entre les fluorophores au sein de la protéine de fusion ainsi que le recouvrement du spectre d’émission du donneur (Alexa488) avec le spectre d’absorption de l’accepteur (Cy5) (Figure 2B, surface hachurée) sont deux conditions favorables à l’établissement d’un transfert d’énergie intramoléculaire (Figure 2A). Ce transfert d’énergie peut être mis en évidence par l’augmentation du signal de l’Alexa488 (500 - 600 nm) après photoblanchiment du Cy5 (Figure 2C, 2D). Dans cette expérience l’accepteur a été complètement photoblanchi c’est-à-dire jusqu’à ce que son signal (650 - 700 nm) après photoblanchiment se trouve au niveau du signal provenant de cellules voisines non transfectées (bruit de fond). L’efficacité du transfert d’énergie EA dans cette expérience de photoblanchiment de l’accepteur peut être calculée à partir de la formule suivante :
EA = FDpost – FDpre / FDpost = E × α × β
FDpost représente le signal du donneur après photoblanchiment de l’accepteur et FDpre représente le signal du donneur avant photoblanchiment de l’accepteur. α est la fraction de donneur interagissant avec l’accepteur et β la fraction d’accepteurs photoblanchis par rapport à la fluorescence initiale de l’accepteur avant photoblanchiment (100 % dans cette expérience). Comme il s’agit ici d’une protéine de fusion avec en tandem les deux protéines SNAP-tag et CLIP-tag portant respectivement le fluorophore donneur et accepteur (rendement de marquage de SNAP-tag et CLIP-tag = 100 %), la valeur de α est égale à 1. De fait, la valeur de l’efficacité du FRET mesurée est égale à l’efficacité du FRET réelle. Dans cette expérience l’efficacité du FRET a été calculée à partir de la moyenne des mesures réalisées sur 30 cellules différentes. La valeur obtenue pour E est de 39 ± 6 % (± standard déviation). En ignorant les possibles changements d’orientation relatifs des moments dipolaires de l’émission du donneur et de l’absorption de l’accepteur on peut déterminer la distance apparente entre les deux fluorophores, d = 60 Å (ångström).
Plus généralement le DFRAP utilise la paire de protéines fluorescentes CFP/YFP. Cependant des travaux publiés en 2005 ont permis de mettre en évidence que le photoblanchiment de la YFP s'accompagne de l'apparition d'un signal de fluorescence dans le canal de la CFP et cela en absence de CFP. Ces travaux montrent aussi que la Citrine et la Venus peuvent, après photoblanchiment, générer des espèces présentant une émission similaire à celle de la CFP. Le mécanisme de conversion de la eYFP, Citrine et Venus en CFP-like n'est à ce jour pas connu.