La transcriptomique est l'étude de l'ensemble des ARN produits lors du processus de transcription d'un génome, c'est-à-dire lors de la production passage de la molécule d'ADN à celle d'ARN. Les ARN peuvent être codant ou non codant. Un transcriptome capture un instantané dans le temps de l'ensemble des transcrits présents dans une cellule. La transcriptomique permet de savoir quels processus cellulaires sont potentiellement actifs et lesquels sont dormants. En particulier, la transcriptomique permet de savoir quels gènes sont exprimés et lesquels ne le sont pas.
Les premières tentatives d'étude des transcriptomes entiers ont commencé au début des années 1990. Les avancées technologiques qui ont suivi depuis la fin des années 1990 ont transformé le domaine à plusieurs reprises et ont fait de la transcriptomique une discipline très répandue dans les sciences biologiques. Il existe deux techniques contemporaines clés dans ce domaine : les puces à ADN, qui quantifient un ensemble de séquences prédéterminées, et le séquençage de l'ARN, qui utilise le séquençage à haut débit pour enregistrer tous les transcrits. Au fur et à mesure que la technologie s'est améliorée, le volume de données produites par chaque expérience sur le transcriptome a augmenté. En conséquence, les méthodes d'analyse des données ont été régulièrement adaptées pour analyser de manière plus précise et plus efficace des volumes de données de plus en plus importants. Les bases de données transcriptomiques se sont donc enrichies et sont devenues de plus en plus utiles au fur et à mesure que les chercheurs continuaient à collecter et à partager des transcriptomes. Il serait presque impossible d'interpréter les informations contenues dans un transcriptome sans la connaissance des expériences précédentes.
La mesure de l'expression des gènes d'un organisme dans différents tissus ou conditions, ou à différents moments, fournit des informations sur la manière dont les gènes sont régulés et révèle des détails de la biologie d'un organisme. Elle peut également être utilisée pour déduire les fonctions de gènes qui n'avaient pas été auparavant. L'analyse du transcriptome a permis d'étudier la façon dont l'expression des gènes change dans différents organismes et a joué un rôle déterminant dans la compréhension des maladies humaines. L'analyse de l'expression des gènes dans son intégralité permet de détecter des tendances générales coordonnées qui ne peuvent être discernées par des tests plus ciblés.
Historique thumb|Articles publiés faisant référence à l'ARN-seq (noir), au puces à ADN (rouge), à l'affichage différentiel numérique (vert), à l'étiquette de séquence exprimée (bleu) et à l'analyse sérielle/cap de l'expression des gènes (jaune) de 1990 à 2017. La transcriptomique a été marquée par une évolution technologique rapide, avec l'émergence de nouvelles techniques tous les dix ans environ, repoussant sans cesse les limites du possible et rendant obsolètes les technologies précédentes. La première tentative de saisie d'un transcriptome humain partiel a été publiée en 1991 et faisait état de 609 séquences d'ARNm provenant du cerveau humain. En 2008, deux transcriptomes humains, composés de millions de séquences dérivées de transcriptions couvrant 16 000 gènes, ont été publiés et en 2015, des transcriptomes avaient été publiés pour des centaines d'individus. Des transcriptomes de différents états pathologiques, de tissus ou même de cellules uniques sont désormais régulièrement générés. Cette explosion de la transcriptomique est due au développement rapide de nouvelles technologies plus sensibles et plus économiques.
Avant la transcriptomique Des études de individuels étaient réalisées plusieurs décennies avant l'apparition des approches transcriptomiques. À la fin des années 1970, des de transcrits d'ARNm de ver à soie ont été collectées et converties en ADN complémentaire (ADNc) pour être stockées par transcriptase inverse. Dans les années 1980, le séquençage à bas débit par la méthode de a permis de séquencer des transcrits aléatoires, produisant ainsi des marqueurs de séquence exprimée (MSE). La méthode de Sanger a été prédominante jusqu'à l'avènement des méthodes à haut débit telles que le séquençage par synthèse (Solexa/Illumina). Les MSE ont pris de l'importance dans les années 1990, car elles constituaient une méthode efficace pour déterminer le contenu génétique d'un organisme sans séquencer l'intégralité du génome. Les quantités de transcriptions individuelles ont été quantifiées à l'aide de méthodes de transfert d'acide ribonucléique, et plus tard, de réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcriptase inverse (RT-qPCR), mais ces méthodes sont laborieuses et ne peuvent capturer qu'une infime sous-section d'un transcriptome. Par conséquent, la manière dont un transcriptome dans son ensemble est exprimé et régulé est restée inconnue jusqu'à ce que des techniques à plus haut débit soient développées.
Premières tentatives Le mot « transcriptome » a été utilisé pour la première fois dans les années 1990. En 1995, l'une des premières méthodes transcriptomiques basées sur le séquençage a été mise au point, l'analyse en série de l'expression des gènes (SAGE), qui repose sur le séquençage Sanger de fragments de transcription aléatoires concaténés. Les transcrits sont quantifiés en faisant correspondre les fragments à des gènes connus. Une variante de SAGE utilisant des techniques de séquençage à haut débit, appelée analyse numérique de l'expression génique, a également été brièvement utilisée. Toutefois, ces méthodes ont été largement dépassées par le séquençage à haut débit de transcrits entiers, qui a fourni des informations supplémentaires sur la structure des transcrits, telles que les variantes d'épissage.
Développement de techniques contemporaines + Comparaison des méthodes contemporainesARN-SeqPuce à ADNThroughput1 jour à 1 semaine par expérience1 à 2 jours par expérienceFaible ~ 1 ng d'ARN totalÉlevé ~ 1 μg d'ARNmIntensité du travailÉlevé (préparation des échantillons et analyse des données)FaibleConnaissances préalablesAucune n'est requise, bien qu'une séquence de génome/transcriptome de référence soit utileLe génome/transcriptome de référence est requis pour la conception des sondesPrécision de la quantification~90 % (limité par la couverture de la séquence)> 90 % (limité par la précision de détection de fluorescence)Résolution de séquenceL'ARN-Seq peut détecter les SNP et les variantes d'épissage (limité par la précision du séquençage d'environ 99 %)Des matrices spécialisées peuvent détecter les variantes d'épissage de l'ARNm (limitées par la conception de la sonde et l'hybridation croisée)Sensibilité1 transcription par million (approximatif, limité par la couverture de la séquence)1 transcription pour mille (approximatif, limité par la détection de fluorescence)Plage dynamique100,000:1 (limité par la couverture de la séquence)1,000:1 (limité par la saturation de fluorescence)Reproductibilité technique>99%>99% Les techniques contemporaines dominantes, les puces à ADN et le séquençage de l'ARN, ont été développées au milieu des années 1990 et 2000. Les puces à ADN, qui mesurent l'abondance d'un ensemble défini de transcrits par à un réseau de complémentaires, ont été publiées pour la première fois en 1995. La technologie des puces à ADN a permis de tester simultanément des milliers de transcrits, à un coût par gène et en main-d'œuvre considérablement réduits. Les puces à ADN à points et les puces à haute densité Affymetrix ont été les méthodes de choix pour le profilage transcriptionnel jusqu'à la fin des années 2000. Durant cette période, une gamme de puces à ADN a été produite pour couvrir des gènes connus dans des organismes modèles ou d'importance économique. Les progrès dans la conception et la fabrication des puces ont amélioré la spécificité des sondes et ont permis de tester davantage de gènes sur une seule puce. Les progrès dans la détection par fluorescence ont augmenté la sensibilité et la précision des mesures pour les transcrits de faible abondance.
Le séquençage de l'ARN est réalisé par transcription inverse de l'ARN in vitro et séquençage des ADNc obtenus. L'abondance des transcrits est déduite du nombre de comptes de chaque transcrit. Cette technique a donc été fortement influencée par le développement des technologies de séquençage à haut débit. Le (SSMP) en est un exemple précoce, basé sur la génération de séquences de 16 à 20 paire de bases via une série complexe d'hybridations, et a été utilisé en 2004 pour valider l'expression de dix mille gènes chez Arabidopsis thaliana. Les premiers travaux sur le séquençage de l'ARN ont été publiés en 2006, avec cent mille transcrits séquencés grâce à la technologie 454. Cette couverture était suffisante pour quantifier l'abondance relative des transcrits. Le séquençage de l'ARN a commencé à gagner en popularité après 2008, lorsque les nouvelles technologies Solexa/Illumina ont permis d'enregistrer un milliard de séquences de transcrits. Ce rendement permet désormais la quantification et la comparaison des transcriptomes humains.
Collecte de données La génération de données sur les transcrits d'ARN peut être réalisée selon deux principes principaux : le séquençage de transcrits individuels (EST ou ARN-Seq) ou l'hybridation de transcrits à un réseau ordonné de sondes nucléotidiques (microarrays).
Isolement de l'ARN Toutes les méthodes transcriptomiques nécessitent l'isolement préalable de l'ARN de l'organisme expérimental avant l'enregistrement des transcrits. Bien que les systèmes biologiques soient extrêmement diversifiés, les techniques d' sont globalement similaires et impliquent la ou des tissus, la rupture de la ribonucléase par des sels chaotropiques, la rupture des macromolécules et des complexes nucléotidiques, la séparation de l'ARN des biomolécules indésirables, dont l'ADN, et la concentration de l'ARN par précipitation en solution ou élution à partir d'une matrice solide. L'ARN isolé peut également être traité par la désoxyribonucléase pour digérer toute trace d'ADN. Il est nécessaire d'enrichir l'ARN messager, car les extraits d'ARN total sont généralement composés à 98 % d'acide ribonucléique ribosomique. L'enrichissement des transcrits peut être réalisé par des méthodes d'affinité poly-A ou par déplétion de l'ARN ribosomique à l'aide de sondes spécifiques de séquence. L'ARN dégradé peut affecter les résultats en aval ; Par exemple, l'enrichissement en ARNm à partir d'échantillons dégradés entraînera l'épuisement des extrémités 5' de l'ARNm et un signal irrégulier sur toute la longueur du transcrit. La congélation rapide des tissus avant l'isolement de l'ARN est courante, et une attention particulière est portée à la réduction de l'exposition aux enzymes RNase une fois l'isolement terminé.
Marqueur de séquence exprimée
Un marqueur de séquence exprimée (MSE) est une courte séquence nucléotidique générée à partir d'un seul transcrit d'ARN. L'ARN est d'abord copié sous forme d'ADN complémentaire (ADNc) par une enzyme transcriptase inverse avant que l'ADNc résultant ne soit séquencé. Les MSE pouvant être collectées sans connaissance préalable de l'organisme dont elles proviennent, elles peuvent être fabriquées à partir de mélanges d'organismes ou d'échantillons environnementaux. Bien que des méthodes à haut débit soient désormais utilisées, les bibliothèques de MSE fournissaient couramment des informations de séquence pour les premières conceptions de puces à ADN ; par exemple, une puce à ADN d'orge a été conçue à partir de 350 000 MSE précédemment séquencés.
Analyse en série de l'expression des gènes