thumb|Mélange de bactéries Gram + (S. aureus, violettes) et Gram – (E. coli, roses) visualisées au microscope optique après coloration de Gram.
La coloration de Gram est une technique de coloration microbiologique utilisée pour visualiser les bactéries (et occasionnellement d'autres micro-organismes) au microscope optique. Elle permet de classer la plupart des bactéries en deux catégories selon la composition de leurs enveloppes cellulaires et en particulier de leur paroi : les « Gram positifs », dont la paroi contient une couche épaisse de peptidoglycane qui fixe bien le colorant primaire et résiste à la décoloration ultérieure, et les « Gram négatifs », dont la paroi moins riche en peptidoglycane fixe moins bien le colorant primaire et le laisse échapper sous l'effet de la décoloration. Une contre-coloration finale permet de visualiser les bactéries (et autres structures) décolorées à l'étape précédente.
C'est une technique extrêmement courante en bactériologie médicale et dans d'autres applications du fait de sa simplicité et de son coût modique. Elle ne permet cependant pas de colorer et de classer toutes les bactéries : les principales limitations proviennent soit de la variabilité du résultat, d'une cellule à l'autre et/ou selon les modalités exactes du protocole (bactéries à « Gram variable »), soit de l'imperméabilité de certaines bactéries aux colorants (bactéries non colorables par la méthode de Gram, comme les Mycobactéries). Le mécanisme de la coloration, la signification de ses résultats quant à la structure de la paroi bactérienne, ses applications médicales et les moyens de surmonter les difficultés techniques qu'elle pose ont fait l'objet d'un important volume de recherches depuis sa première description à la fin du .
Histoire
La première mention d'une technique de coloration due au biologiste et médecin danois Hans C. Gram apparaît en 1883 sous la plume de son directeur de laboratoire, Friedländer C « Die Mikrokokken der Pneumonie » Fortschr Med. 1883;1(22):715-733. Accès libre (article en allemand).. Leurs recherches sur l'étiologie des pneumonies les amènent à suspecter le rôle pathogène des cocci fréquemment retrouvés dans les prélèvements, mais les observations microscopiques sont gênées par le manque de spécificité des colorants, qui imprègnent aussi bien les micro-organismes que les noyaux cellulaires des tissus infectés et les dépôts tissulaires de fibrine. Gram consigne en détail sa méthode dans une publication qui paraît début 1884Gram HC « Ueber die isolirte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten » Fortschr Med. 1884;2(6):185-189. Accès libre (article en allemand). : lorsque la coloration primaire au violet de gentiane est suivie de l'application d'une solution d'iode et d'iodure de potassium, ces « microcoques » – probablement des PneumocoquesAustrian R « The Gram stain and the etiology of lobar pneumonia, an historical note » Bacteriol Rev. 1960;24(3):261–265. – se colorent mieux et surtout résistent à l'action décolorante de l'alcool, contrairement aux noyaux et à la fibrine qui sont décolorés. L'observation in situ des micro-organismes est facilitée par l'amélioration du contraste, d'autant plus qu'une contre-coloration au brun Bismarck est déjà intégrée à cette version originale.
Gram ne conçoit pas sa coloration comme un outil de classification des bactéries. Il n'approfondit pas ses travaux à ce sujet et reste très modeste quant à sa découverte, allant jusqu'à qualifier ses résultats de « défectueux et imparfaits »Cantey JB « “A defective and imperfect” method: H. Christian Gram and the history of the Gram stain » Ped Infect Dis J. 2015;34(8):848. . Il note cependant que dans certains cas plus rares de pneumonies bactériennes, les micro-organismes présents dans les tissus – probablement Klebsiella pneumoniae – réagissent différemment : malgré l'exposition à la solution iodée après la coloration primaire, ils se décolorent sous l'effet de l'alcool. Poursuivant l'étude bactériologique des pneumonies, stimulés par les critiques de Fraenkel A « Ueber die genuine Pneumonie (Aetiologie, Pathologie, Klinik, Therapie) » in: Verhandlungen des Congresses für innere Medizin – Dritter Congress, gehalten zu Berlin, 21.–24. April 1884. Wiesbaden : 1884, Verlag von J.F. Bergman, pp.17-31. Accès libre (article en allemand)., FriedländerFriedländer C « Weitere Arbeiten über die Schizomyceten der Pneumonie und der Meningitis » Fortschr Med. 1886;4(21):702-705. Accès libre (article en allemand). et Weichselbaum A « XXXV. Ueber die Aetiologie der acuten Lungen- und Rippenfellentzündungen » Med Jahrbücher. 1886;1:483-554. Accès libre (article en allemand). réalisent assez vite qu'elles ne sont pas dues à un seul et unique agent : à travers le prisme de ces infections, la distinction entre bactéries non décolorables (que l'on appellera « Gram positifs ») et décolorables (les futurs « Gram négatifs ») par la méthode de Gram commence à se dessiner.
La coloration de Gram a suscité un immense intérêt scientifique, s'est rapidement imposée comme une méthode de référence et a donné naissance à d'innombrables variantes destinées à corriger les imperfections du protocole primitif ou à améliorer ses performances dans des contextes particuliers. À titre d'illustration, une publication de 1923 recense déjà dix-neuf de ces variantesHucker GJ « Methods of Gram staining » NY Agric Exp Stn Tech Bull. 1923;93. Accès libre.. Par ordre chronologique, on peut citer entre autres les méthodes de Gram-Nicolle (1895), de Gram-Kopeloff (1922) et de Gram-Hucker (1927). Pour faciliter la coloration de Gram qu'il trouve « difficile à réussir », M. Nicolle ajoute du phénol à la solution de violet de gentiane (colorant primaire), introduit l'usage du mélange acétone-alcool comme décolorant et de la fuchsine basique comme contre-coloration des Gram négatifsNicolle M « Pratique des colorations microbiennes (méthode de Gram modifiée et méthode directe) » Ann Inst Pasteur (Paris). 1895;9(8):664-670. Accès libre. N. Kopeloff et P. Beerman emploient des solutions alcalines de violet de gentiane et d'iode pour améliorer la visibilité des bactéries dans les prélèvements de lait et de matières fécalesKopeloff N & Beerman P « Modified Gram stains » J Infect Dis. 1922;31(5):480-482. . G.J. Hucker ajoute de l'oxalate d'ammonium à la solution de violet de gentiane pour stabiliser le colorant primaire et améliorer la résistance des Gram positifs à la décolorationHucker GJ & Cohn HJ « Further studies on the methods of Gram staining » NY Agric Exp Stn Tech Bull. 1927;128. Accès libre..
Principe Dans sa forme actuelle, la coloration de Gram se déroule en quatre étapes séparées les unes des autres par des rinçages à l'eauPopescu A & Doyle RJ « The Gram stain after more than a century » Biotech Histochem. 1996;71(3):145-151. : une coloration primaire est effectuée par une solution alcoolique de violet cristallisé (forme purifiée du violet de gentiane) ; un mordançage par une solution contenant de l'iode fixe ce colorant primaire dans la paroi des bactéries à Gram positif, composée à 50-90% de peptidoglycane ; une décoloration par un solvant organique (éthanol, acétone ou mélange des deux) élimine le cristal violet de la paroi des bactéries à Gram négatif, composée à seulement 10% de peptidoglycane ; une contre-coloration par un colorant rose ou rouge (safranine ou fuchsine basique) permet de visualiser les Gram négatifs mais ne modifie pas l'aspect des Gram positifs (qui ont retenu leur coloration violette, plus sombre).
Mécanisme biochimique de la coloration
Le mécanisme de la coloration de Gram est fondamentalement lié à la structure de la paroi bactérienne, et les connaissances dans ces deux domaines ont donc progressé de manière parallèle au fil du temps.
Deux grandes catégories d'enveloppes bactériennes
Dans la deuxième moitié du , le développement de la microscopie électronique a permis de préciser les relations entre les résultats de la coloration de Gram (phénotype « macroscopique ») et l'ultrastructure des enveloppes bactériennes. On sait à présent que la plupart des bactéries peuvent être classées en deux catégories d'après la structure microscopique de leurs enveloppes cellulairesSilhavy TJ « The bacterial cell envelope » Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(5):a000414. : on les appelle bactéries « Gram positives » et « Gram négatives », bien que les résultats de la coloration de Gram ne soient pas toujours corrélés à la structure réelle pour des raisons techniques (cf. infra, §Limites intrinsèques). En toute rigueur il faut donc faire la distinction entre aspect Gram positif ou négatif (en microscopie optique après coloration de Gram) et structure Gram positive ou négative (en microscopie électronique).
Les bactéries à structure Gram positive, qui prennent le plus souvent un aspect Gram positif à la coloration, ont des enveloppes constituées d'une seule membrane (on parle de bactéries monodermes) doublée extérieurement d'une paroi épaisse de peptidoglycane et d'acides téichoïquesRohde M « The Gram-positive bacterial cell wall » Microbiol Spectr. 2019;7(3):10.1128/microbiolspec.gpp3-0044-2018. .
Les bactéries à structure Gram négative, qui prennent le plus souvent un aspect Gram négatif à la coloration, ont des enveloppes plus complexes composées de deux membranes (bactéries didermes). La membrane externe est en partie constituée d'une « endotoxine », le lipopolysaccharide, disposée sur son versant externe. Elle est séparée de la membrane interne par un espace périplasmique partiellement occupé par une fine paroi de peptidoglycane Fivenson EM « Co-ordinated assembly of the multilayered cell envelope of Gram-negative bacteria » Curr Opin Microbiol. 2024;79:102479. .
Réalisation Préparation des lames Les frottis et autres préparations bactériologiques destinées à la coloration de Gram sont réalisés de la manière suivanteChan WW « 3.2.1 Gram Stain » in : Leber AL (ed.) Clinical microbiology procedures handbook. Washington, DC : 4th ed, 2016, p. 3.2.1.4 : Dégraisser et stériliser les lames porte-objets avant leur utilisation : utiliser des lames de verre à extrémité dépolie, conservées dans de l'alcool à 95° changé quotidiennement ; au moment de l'utilisation, utiliser une pince métallique pour sortir la lame de l'alcool, l'égoutter et la flamber ; laisser refroidir la lame flambée et reporter sur sa partie dépolie les éléments d'identification (n° de prélèvement, de culture etc.) Pour l'examen direct des urines : déposer 10 µL d'urine bien homogénéisée (non centrifugée) sur une lame à l'emplacement préalablement marqué au crayon gras ; laisser sécher à l'air sans étaler. Pour l'examen direct des autres liquides biologiques (liquides de ponction, de LBA, LCR, etc.) : avec une : déposer 5 à 6 gouttes de prélèvement et une goutte de formol à 37 % dans la chambre de la centrifugeuse, puis actionner l'appareil selon les instructions du fournisseur ; à défaut (quantité trop faible, liquide visqueux, cytocentrifugeuse non disponible) : déposer 1 ou 2 gouttes de prélèvement sur une lame à l'emplacement préalablement marqué au crayon gras, laisser les gouttes se rejoindre, puis laisser sécher à l'air sans étaler ; si besoin, après séchage, rajouter une ou deux gouttes au même endroit. Pour l'examen direct des sécrétions recueillies sur écouvillon : si l'on dispose de deux écouvillons (cas idéal) : en réserver un pour les cultures, faire rouler l'extrémité de l'autre écouvillon sur une lame stérile en procédant délicatement pour éviter de perturber la structure interne des cellules et leur disposition les unes par rapport aux autres. si l'on dispose d'un seul écouvillon : agiter l'écouvillon dans un peu de sérum salé ou de bouillon de culture stérile, essorer l'écouvillon contre le bord interne du tube, réserver la suspension pour inoculer les cultures et utiliser l'écouvillon pour préparer une lame comme précédemment.