vignette|Diagramme des quatre premiers cycles de la PCR. Lamplification en chaîne par polymérase (ACP). ou réaction de polymérisation en chaîne., généralement siglée PCR (de l') est une méthode de biologie moléculaire permettant d'obtenir rapidement, in vitro, un grand nombre de segments d'ADN identiques, à partir d'une séquence initiale... Le terme test d'amplification des acides nucléiques (TAAN), très peu utilisé par les chercheursMoins de 200 articles référencés dans Google Scholar en , contre plus de pour la requête PCR dans les pages en français., est plus restrictif, car il désigne l'application de la PCR à des fins diagnostiques.

Elle permet de multiplier en grand nombre (avec un facteur de l'ordre du milliard) une séquence d'ADN ou d'ARN connue (avec une étape supplémentaire de rétrotranscription pour l'ARN), à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique, et à l'aide d'amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de dix-sept à vingt-cinq nucléotides. Le terme amplicon désigne aussi bien la séquence de départ que le produit obtenu. Cette technique permet, par exemple, de détecter la présence du VIH ou mesurer une charge virale (concentration du virus dans le plasma), des traces d'OGM (organismes génétiquement modifiés), ou encore des virus d'hépatites B, C et D. Elle permet également de préparer des quantités notables d'un fragment donné à des fins d'insertion dans des vecteurs ad hoc (clonage).

De plus en plus utilisée en criminalistique, cette technique se fonde sur la combinaison de deux facteurs : les propriétés de synthèse enzymatique et d’initiation spécifique à l'ADN double brin spécifique des ADN polymérases dépendantes à l'ADN thermostables ; les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température.

Ces éléments permettent de contrôler l’activité enzymatique grâce à des transitions de température (assurées par un thermocycleur) répétées de manière cyclique (cf. réaction en chaîne).

Les premières ADN polymérases utilisées en PCR provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase) ou encore Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase), Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase), Thermus thermophilus (Tth polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles.

En moins de dix ans, on a appris à faire plus d'un milliard de copies en moins d'une heure, ce qui a imposé la PCR dans les laboratoires en révolutionnant la biologie moléculaire. Elle n'est cependant pas fiable pour certaines sources d'échantillons (urine, crachatsInitiation à la biologie moléculaire ; Module : Amplification de gène, Fondation Mérieux.), peut-être en raison d'inhibiteurs de la Taq polymérase.

Historique

La PCR est une technologie qui a bouleversé la biologie moléculaire et s'est implantée très rapidement dans les laboratoires. En revanche, la PCR en temps réel a dû attendre la mise sur le marché d'un certain nombre d'innovations technologiques avant de se développer et est encore considérée comme une méthode nouvelle. Le nombre d'articles par an répondant aux mots clés « polymerase chain reaction » (1) et « real-time polymerase chain reaction » (2) sur le moteur de recherche PubMedPubMed. donne une assez bonne idée de leur importance dans le monde scientifique. La méthode n'est pas exempte de biais, par exemple quelques articles sont trouvés pour la PCR en temps réel en 1991 et 1992 (en pointillé) alors que son principe n'a été décrit qu'en 1993. La différence (1-2) est représentative du poids de la PCR en point final, qui va probablement céder progressivement la place au temps réel.

Cette technique a largement évolué depuis ses débuts. Parmi les évolutions les plus fondamentales, on retrouve : le remplacement du fragment de Klenow d’ADN polymérase I d’E . coli par une polymérase thermorésistante (initialement la Taq polymérase) qui évite de devoir remettre de l’enzyme à chaque cycle. Cette innovation permet un bond énorme vers l’automatisation et évite de devoir ouvrir le tube réactionnel, limitant considérablement le risque de contamination ; la généralisation des thermocycleurs (un bon nombre d’anciennes expérimentations ont été réalisées avec trois bains-marie) a permis de rendre la PCR moins contraignante, plus reproductible et était un prérequis indispensable à la plupart des applications nouvelles ; l'invention de la PCR en temps réel qui permet de rendre la méthode quantitative et évite plusieurs étapes expérimentales contraignantes, telles l’électrophorèse sur gel d’agarose, l’acquisition de fluorescence, la calibration de l’acquisition du signal

Voici un bref historique des publications importantes au sujet du PCR :

1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey Watson et Francis Harry Compton Crick (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962), d'après les travaux de Rosalind Franklin. 1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959). 1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par Howard Martin Temin et David Baltimore (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975). 1971 : Première description méthodologique de la PCR par le Norvégien dans une publication scientifique édité par Journal of Molecular Biology.. La première expérience de PCR remonte alors à 1969, dans le laboratoire de Har Gobind Khorana (prix Nobel de 1968), à l'Université du Wisconsin-Madison, USA. La paternité de la PCR ne leur sera cependant pas attribuée. 1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993.). 1988 : Première PCR réalisée avec une ADN polymérase thermostable, provenant de Thermus aquaticus, par R. K. Saiki. 1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par P. M. Holland. 1992 : Invention de la PCR en temps réel par Russell Higuchi. 1995 : Première publication sur la TAIL-PCR par Liu YG 1996 : Mise au point des polymérases temporairement inactives et activables par la chaleur par Birch DE. 1997 : Mise en évidence de la variation de température "Tm dépendante" du SYBR green par Wittwer CT. 1997 : Première discrimination d’allèle grâce à la courbe de fusion par Lay MJ.

Principe

La PCR est une technique basée sur une répétition de cycles de transition de température. Sauf pour certaines méthodes (par exemple l’utilisation de sondes d’hydrolyse), chaque cycle contient trois étapes détaillées ci-dessous. Par souci de didactisme, nous allons considérer pour l’exemple qui suit une efficacité de PCR de 100 %.

Étapes de la PCR Conditions natives (0 sur le schéma) Cette étape se fait généralement à température ambiante. L’ADN bicaténaire adopte sa conformation en double hélice. Dans cet exemple, nous considérerons qu’il n’y a qu’une molécule initiale d’ADN double brin dans la solution, la zone colorée (magenta et orange) correspondant à notre amplicon. Note : les ADN complémentaires issus de la transcription inverse sont généralement de simples brins et adopteront alors de complexes conformations tridimensionnelles similaires à celle des ARN.

Dénaturation initiale (1’ sur le schéma) Avant de commencer les cycles de PCR proprement dit, une étape de chauffage (généralement à ) est réalisée. Cette étape permet de : déshybrider les ADN double brin, de casser les structures secondaires, d’homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique, d’activer les polymérases de type « Hot start », de dénaturer d’autres enzymes qui pourraient être dans la solution (Transcriptase Inverse, Uracil-N-Glycosylase).

Phase de dénaturation (1 sur le schéma) Cette étape (généralement 0 à 1 minute à ) permet de déshybrider les ADN, de « décrocher » les polymérases qui seraient encore liées à une matrice et d’homogénéiser le milieu réactionnel.

Phase d’hybridation ou d'appariement des amorces (2 sur le schéma) Cette étape (généralement à ) permet aux amorces sens et anti-sens de s’hybrider aux ADN matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. Peu de brins d’ADN matrice peuvent s’hybrider (se lier) avec leur brin complémentaire, ce qui empêcherait la fixation des amorces, car ces dernières sont bien plus courtes et en concentration bien plus importante. Expérimentalement, il est constaté que la PCR fonctionne même avec une phase d’hybridation avec une température supérieure de quelques degrés au Tm théorique des amorces, probablement parce qu’elles interagissent déjà avec les polymérases, qui stabiliseraient leur hybridation à l’ADN matrice.

Caractéristiques des amorces

les séquences nucléotidiques des amorces doivent être spécifiques des séquences complémentaires de l'ADN simple-brin auxquelles elles vont s'apparier. La complémentarité parfaite n'étant par ailleurs pas obligatoire. De plus la spécificité de la séquence est importante dans la mesure où celle-ci ne doit pas pouvoir s'apparier à une autre séquence de l'ADN que l'on souhaite répliquer ; les séquences des amorces doivent être choisies de sorte à minimiser les possibilités d'appariement entre elles. De même chaque amorce est choisie pour ne pas pouvoir former une structure secondaire ; le procédé même de la PCR reposant, entre autres, sur des équilibres thermodynamiques, les amorces doivent avoir des températures de fusion le plus proche possible, autrement dit le rapport entre les bases AT et GC des deux amorces ne doit pas être trop différent.

Phase d’élongation (3 sur le schéma) Cette étape (généralement à ) permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire de leur ADN matrice à une température qui leur est optimale. Ce brin est fabriqué à partir des dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend normalement de la longueur de l’amplicon.

Évolution de l'ADN au cours des quatre premiers cycles Cycle Lors de la phase 1, nous constatons que l’ADN initial a adopté une conformation « linéaire » (sans structure secondaire) et simple brin. Les amorces, les dNTPs et les polymérases sont en large excès et répartis de façon homogène dans la solution. Lors de la phase 2, une des amorces sens s’hybride avec sa séquence complémentaire sur le brin anti-sens (en magenta), une des amorces anti-sens se liant elle au brin sens (en orange). Deux polymérases peuvent alors interagir avec les deux complexes amorces/ADN matrice. Lors de la phase 3, les polymérases parcourent leur brin matrice de son extrémité 3’ vers son extrémité 5’ tout en synthétisant le brin complémentaire. Elles s’arrêteront à la fin du cycle, décrochées par la phase de dénaturation du cycle suivant. Les ADN néo-synthétisés sont donc précisément définis à leur extrémité 5’ mais pas à leur extrémités 3’ (parties noires). Les ADN sont alors bicaténaires sur une longueur plus ou moins importante.

À la fin de l’étape 3, nous avons alors deux brins d’ADN matrice et deux brins (un sens et un anti-sens) d’ADN précisément définis à leur extrémité 5’ uniquement.

Cycle Les trois phases se déroulent de la même manière qu’au cycle , sauf que deux polymérases arrivées au bout de leur ADN matrice se décrochent spontanément. À la fin de la phase 3, nous obtenons tous les types d’ADN qui existeront lors de la PCR, soit : un brin d’ADN natif sens (A) ; deux brins d’ADN anti-sens précisément définis à leur extrémité 5’ uniquement (B) ; un brin d’ADN sens correspondant à l’amplicon, c'est-à-dire précisément défini à ses deux extrémités (C) ; deux brins d’ADN sens précisément définis à leur extrémité 5’ uniquement (D) ;