A pegada xenética ou perfil de ADN (do inglés DNA fingerprinting ou DNA profiling) ou tamén proba do ADN, análise de ADN, pegada dactilar do ADN ou tipificación do ADN é unha técnica empregada en ciencia forense para axudar á identificación de individuos segundo certas particularidades do seu ADN. As pegadas xenéticas ou perfís de ADN son conxuntos encriptados de números que indican como está formado o ADN dunha persoa nas porcións examinadas, polo que poden utilizarse para identificar a unha persoa, por exemplo, en probas de paternidade ou investigación criminal. Tamén teñen usos filoxenéticos e en identificacións microbiolóxicas. A pegada xenética non debe confundirse coa secuenciación completa do xenoma, xa que só se secuencian unhas porcións concretas do xenoma distintivas.Kijk magazine, 1 de xaneiro de 2009
Aínda que o 99% das secuencias de ADN humanas son as mesmas en todas as persoas, o resto do ADN ten diferenzas dabondo como para distinguir un individuo doutro, agás no caso dos xemelgos monocigóticos. O que se analiza nas probas da pegada xenética son determinadas secuencias repetitivas e non codificantes que hai no ADN do xenoma humano, que son moi variables en canto ao seu número de repeticións, denominadas repeticións en tándem de número variable (VNTR), especialmente un grupo delas denominadas repeticións en tándem curtas ou STR (short tandem repeats). Os loci VNTR son moi similares entre seres humanos emparentados, pero como son moi variables en canto ao seu número de repeticións, é extremadamente improbable que individuos non emparentados teñan o mesmo número de repeticións nos VNTR se analizamos o número suficiente deles.
A técnica do perfil de ADN foi descuberta en 1984Joseph Wambaugh, The Blooding (New York: A Perigord Press Book, 1989), 83. por Alec Jeffreys na Universidade de Leicester en Inglaterra,Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.W. (1984). "Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA". Nature 314: 67–73. . e empezou a estar dispoñible comercialmente en 1987.Joseph Wambaugh, The Blooding (New York: A Perigord Press Book, 1989), 202. Agora hai bases con datos de perfil de ADN en moitos países baseadas nesa técnica.
Procedemento para a obtención da pegada xenética miniatura|esquerda|240px|Variacións das lonxitudes dos alelos VNTR en 6 individuos. miniatura|200px|Alec Jeffreys, o pioneiro da pegada xenética. O proceso empeza coa obtención dunha mostra do ADN dun individuo (xeralmente chamada "mostra de referencia"). O método preferible para recoller a mostra de referencia é facer un frotis bucal cun bastonciño de algodón, xa que isto reduce a posibilidade de contaminación. Cando isto non é posible (por exemplo, porque non hai unha orde xudicial para obtela ou non é posible obtela) outro método é recoller mostras de sangue, saliva, seme, ou outros fluídos apropiados nos que floten células ou de tecidos procedentes de obxectos ou roupas de uso persoal (cepillo de dentes, coitelas de afeitar etc.) ou de mostras almacenadas (por exemplo, bancos de esperma ou tecidos de biopsias). As mostras obtidas do sangue de parentes biolóxicos do individuo poden tamén dar unha indicación do perfil de ADN do individuo, igual que restos humanos.
A mostra de referencia debe ser entón analizada para crear o perfil de ADN do individuo utilizando varias técnicas posibles, que se explican a continuación. O perfil de ADN compárase coas outras mostras para determinar se hai coincidencia.
Técnica inicial: análise de RFLP
O primeiro método de análise xenética que se utilizou historicamente para obter a pegada xenética requiría a dixestión do ADN cun encima de restrición, seguida da aplicación da técnica da Southern blot. Aínda que poden existir polimorfismos nos sitios de clivaxe no ADN nos que actúan os encimas de restrición, o máis común era que os encimas e sondas de ADN se utilizasen para analizar loci VNTR. Porén, a técnica da Southern blot é laboriosa e require grandes cantidades de mostra de ADN non degradado. Ademais, a técnica orixinal de Karl Brown examinaba moitos loci minisatélite ao mesmo tempo, incrementando a variabilidade observada, o que fai difícil distinguir alelos individuais (e, por tanto, excluían as probas de paternidade). Estas técnicas que se aplicaron inicialmente foron despois substituídas por ensaios baseados na técnica da PCR.
Análise de PCR
En 1985 descubriuse un procedemento mediante o cal porcións específicas dunha mostra de ADN poden ser amplificadas case indefinidamente (fanse millóns de copias delas). A técnica, denominada Reacción en cadea da polimerase ou PCR revolucionou todos os estudos de ADN, e imita o proceso biolóxico da replicación do ADN, pero aplicado a secuencias específicas de ADN que interesan.
Neste proceso, a mostra de ADN desnaturalízase, polo que as súas febras se separan. Utilízanse dous cebadores ou primers de ADN para que se hibriden con dous sitios complementarios nas dúas febras do ADN, de tal modo que se produza a extensión encimática normal do terminal activo dos cebadores (o extremo 3') e se faga unha copia complementaria da febra. Deste modo xéranse dúas novas copias da secuencia que interesa.
A repetida desnaturalización, hibridación e extensión feita deste xeito produce un crecemento exponencial no número de copias do ADN de interese. A desnaturalización realízase xeralmente mediante o quentamento da mostra, polo que os encimas de replicación utilizados son tolerantes ás altas temperaturas (úsase a ADN polimerase Taq). Hai aparellos que automatizan o proceso (termocicladores). Poden orixinarse así millóns de copias da rexión de ADN desexada en só dúas horas ou menos.
Coa invención da PCR, os perfís de ADN deron unha grande paso cara a adiante tanto no seu poder de discriminación coma na capacidade de obter información de mostras moi pequenas (ou parcialmente degradadas). A PCR amplifica enormemente a cantidade dunha rexión específica do ADN, utilizando cebadores (oligonucleótidos) e ADN polimerases termoestables (Taq). As primeiras probas rápidas como as tiras de dot blot inversas do HLA-DQ alfa chegaron a facerse moi populares nalgúns países debido ao seu fácil uso e a rapidez coa que se podían obter os resultados. Porén, non tiñan un poder de discriminación tan grande coma a RFLP. Era tamén difícil de determinar a pegada xenética de mostras mixtas, como as que se recollen en frotis vaxinais en casos de violación.
O método da PCR foi facilmente adaptable á análise de VNTR, especialmente á dos loci STR. Nos últimos anos a investigación na cuantificación do ADN humano está enfocada nas técnicas da PCR cuantitativa (qPCR) en "tempo real". Os métodos de PCR cuantitativa permiten facer medicións de alto rendemento, precisas e automáticas. Os estudos feitos en distintos laboratorios demostraron a importancia da cuantificación do ADN para conseguir unha interpretación fiable da tipificación dos STR e obter resultados consistentes entre diferentes laboratorios.
Análise STR
O método da análise da pegada xenética utilizado hoxe está baseado na PCR e na análise de repeticións en tándem curtas (STR). Este método utiliza rexións moi polimórficas que teñen secuencias repetidas curtas no ADN (a máis común é unha repetición de 4 bases, pero úsanse tamén outras lonxitudes, como as de 3 ou 5 bases). Como as persoas que non están emparentadas teñen case con certeza diferente número de unidades repetidas, as STRs poden utilizarse para discriminar entre individuos non emparentados. Estes loci STR (situados en determinadas localizacións no cromosoma) son a diana á que se unen cebadores específicos de secuencia e son amplificados utilizando a PCR. Os fragmentos de ADN que se orixinan son despois separados en función do seu tamaño e detectados por medio de electroforese. Hai dous métodos comúns de separación e detección, que son: electroforese capilar e electroforese en xel.
Todos os STR son polimórficos, pero o número de alelos é moi pequeno. O típico é que cada alelo STR sexa compartido por arredor de 5 - 20% dos individuos. Para analizar os loci STR deben examinarse moitos loci STR simultaneamente, xa que se se examinan poucos poden coincidir por casualidade entre dúas persoas da poboación. Cantas máis rexións STR se comproben nun individuo máis poder discriminatorio terá a proba. O patrón de alelos pode identificar a un individuo con grande exactitude.
Segundo o país utilízanse diferentes sistemas de perfil de ADN baseados nos STR. Nos Estados Unidos utilízase o sistema CODIS, que examina 13 loci, e no Reino Unido úsase o sistema SGM+ de 11 loci (que é compatible coa Base de datos de ADN nacional dese país), e que son 10 loci STR e mais a proba de sexo. Moitas das rexións STR usadas son as mesmas nos sistemas de distintos países. Estes sistemas de perfil de ADN están baseados en reaccións múltiplex, polo que se comproban moitas rexións STR ao mesmo tempo.
O poder da análise de STR depende da súa capacidade estatística de discriminación. Por exemplo, os 13 loci que se usan actualmente no CODIS están en distintos cromosomas e teñen distribución independente (ter certo número de repeticións nun locus non cambia a probabilidade de ter calquera número de repeticións noutro locus), polo que pode aplicarse o produto das probabilidades de cada locus. Isto significa que se alguén ten o tipo de ADN ABC, no cal os tres loci son independentes, podemos obter a probabilidade de ter o tipo ABC multiplicando a probabilidade de ter A pola de ter B e pola de ter C. Na práctica esta multiplicación faríase cos 11 ou 13 loci STR usados segundo o país, obtendo probabilidades de obter na poboación un perfil de ADN igual de aproximadamente só 1 entre 1x1018. Porén, as procuras nas bases de datos mostran con moita máis frecuencia da agardada falsas correspondencias entre perfís de ADN. Ademais, como hai uns 12 millóns de xemelgos monocigóticos no mundo, a probabilidade calculada teoricamente non é exacta.
Na práctica, o risco de correspondencias contaminadas é moito maior que o de correspondencias cun parente distante, como ocorre con mostras contaminadas por obxectos próximos ou por restos de células transferidas desde unha proba anterior. Loxicamente, o risco de correspondencia é maior coa persoa máis común nas mostras: calquera cousa recollida da vítima ou en contacto con ela é unha fonte principal de contaminación para calquera outra mostra traída ao laboratorio. Por esa razón, o normal é examinar moitas mostras de control para asegurar que permaneceron limpas, cando estas se prepararon durante o mesmo período que a mostra real. Correspondencias inesperadas (ou variacións) en varias mostras de control indican unha alta probabilidade de contaminación na mostra real. Nunha proba de parentesco, o perfil de ADN en conxunto debería diferir (excepto en xemelgos) para probar que unha persoa non está realmente dando unha correspondencia co seu propio ADN presente noutra mostra.
AmpFLP