A cromatografía de afinidade é un método de separar mesturas bioquímicas baseándose nunha interacción moi específica que se establece entre un antíxeno e un anticorpo, encima e substrato, receptor e ligando, ou proteína e ácido nucleico. É un tipo de técnica de laboratorio cromatográfica usada para purificar moléculas biolóxicas que forman parte dunha mestura aproveitando as propiedades moleculares. As macromoléculas biolóxicas, como encimas e outras proteínas, interaccionan con outras moléculas con alta especificidade por medio de diferentes tipos de enlaces e interaccións. Tales interaccións poden ser enlaces de hidróxeno, interaccións iónicas, pontes disulfuro, interaccións hidrófobas e outras. A alta selectividade da cromatografía de afinidade débese a que se permite que a molécula desexada interaccione coa fase estacionaria e se una na columna cromatográfica para ser separada do material non desexado, que non interaccionará e sairá primeiro nas elucións. As moléculas que xa non se necesitan son primeiro retiradas por lavado cun tampón mentres que as proteínas desexadas se deixan baixar en presenza do solvente eluente (de alta concentración salina). Este proceso crea unha interacción competitiva entre a proteína desexada e as moléculas estacionarias inmobilizadas, que finalmente permite que as proteínas agora altamente purificadas sexan liberadas.
Uso
A cromatografía de afinidade pode utilizarse para purificar e concentrar unha substancia nunha mestura nunha solución tamponada, reducir a cantidade de substancias non desexadas na mestura, identificar os compoñentes biolóxicos que se unen a unha determinada substancia, ou purificar e concentrar unha solución encimática. A molécula de interese pode ser inmobilizada por medio de enlaces covalentes. Isto ocorre utilizando unha matriz insoluble como un medio cromatográfico como a celulosa ou a poliacrilamida. Cando o medio se une á proteína de interese esta queda inmobilizada.
Principio
En resumo, a cromatografía de afinidade aproveita as diferenzas nas forzas de interacción entre as diferentes biomoléculas nunha fase móbil e na fase estacionaria. A fase estacionaria cárgase primeiro nunha columna cunha fase móbil que contén diversas biomoléculas desde ADN a proteínas (dependendo do experimento de purificación). Entón, déixase tempo para que as dúas fases se unan. Despois vértese un tampón de lavado na columna que contiña as dúas fases. O tampón de lavado arrastra as biomoléculas que non son a diana ao afectar ás súas débiles interaccións coa fase estacionaria. As biomoléculas diana teñen moita maior afinidade pola fase estacionaria, e permanecen unidas á fase estacionaria, e non son arrastradas polo tampón de lavado. Seguidamente, déitase un tampón de elución na columna que contén as restantes moléculas diana. O tampón de elución altera as interaccións entre as biomoléculas diana unidas coa fase estacionaria en moito maior grao que co tampón lavador, o que elimina efectivamente as biomoléculas diana. Esta solución purificada contén o tampón de elución e biomoléculas diana, e denomínase elución.
A fase estacionaria é normalmente unha matriz de xel, xeralmente de agarosa; unha molécula de azucre lineal procedente das algas. Para impedir a interferencia estérica ou o solapamento durante o proceso de unión da molécula diana co ligando, adhírese primeiro ás boliñas de agarosa (soporte sólido) un inhibidor que contén unha cadea hidrocarbonada. Este inhibidor con cadea hidrocarbonada adoita denominarse espazador, situado entre a boliña de agarosa e a molécula diana.
Xeralmente, o punto de partida é un grupo de moléculas heteroxéneo cru dun extracto celular completo como un lisado celular, medio de crecemento ou soro sanguíneo. A molécula de interese ten que ter unha propiedade definida coñecida, que poida ser aproveitada durante o proceso de purificación de afinidade. O propio proceso pode considerarse unha captura nunha trampa, xa que a molécula diana é atrapada nunha fase ou medio estacionario sólido. As outras moléculas da fase móbil non quedan atrapadas, xa que non posúen esa propiedade. A fase estacionaria pode despois ser retirada da mestura, lavada, e a molécula diana liberada do seu atrapamento nun proceso chamado diálise. As moléculas desexadas son eluídas con substancias específicas despois de retirar por lavado as moléculas que non interaccionan. Así, isto produce un material altamente purificado. A elución altamente específica das macromoléculas desexadas da fase estacionaria é xeralmente efectuada engadindo ao tampón de elución un gradiente do mesmo tipo sobre a macromolécula e así desprazala. Posiblemente o uso máis común da cromatografía de afinidade é a purificación de proteínas recombinantes. A cromatografía de afinidade é unha excelente elección para o primeiro paso na purificación dunha proteína ou ácido nucleico a partir dunha mestura crúa.
A cromatografía de afinidade pode aplicarse tamén cando descoñecemos o peso molecular, hidrofobicidade, carga etc. dunha proteína. Un exemplo desta situación dáse cando se trata de encontrar un encima cunha actividade determinada, no que se podería construír unha columna de afinidade cun ligando unido que é similar ou idéntico ao substrato de elección. O modo en que o encima desexado será eluído a partir da mestura baséase nas fortes interaccións do encima e o análogo do substrato inmobilizado, que se producirían selectivamente a través da columna de afinidade. Entón, pode realizarse a elución do encima co substrato apropiado.
Equipos en columna e en lotes miniatura|Columna de cromatografía|170px170px|miniatura|Cromatografía en lotes
A unión á fase sólida pode conseguirse usando cromatografía en columna na que o medio sólido está metido nunha columna, a mestura inicial baixa a través da columna para que se vaia asentando, bótase un tampón de lavado pola columna e o tampón de elución despois e recóllese. Estes pasos fanse xeralmente a presión ambiental. Alternativamente, pode conseguirse a unión usando un tratamento por lotes, por exemplo, engadindo a mestura inicial á fase sólida nun recipiente, mesturando, separando a fase sólida, retirando a fase líquida, lavando, recentrifugando, engadindo o tampón de elución, recentrifugando e eliminando o eluato.
Ás veces utilízase un método híbrido no que a unión se fai polo método de lotes, pero a fase sólida coa molécula diana unida é metida nunha columna e os lavados e as elucións fanse na columna.
Os ligandos usados na cromatografía de afinidade obtéñense tanto de fontes orgánicas coma inorgánicas. Exemplos de fontes biolóxicas son as proteínas séricas, lectinas e anticorpos. Fontes inorgánicas son o ácido morónico, quelatos de metais e tinguiduras de triazina.
Desenvolveuse tamén un terceiro método, a absorción en leito expandido, que combina as vantaxes dos dous métodos mencionados antes. As partículas da fase sólida son situadas nunha columna onde a fase líquida é bombeada desde o fondo e sae pola parte superior. A masa das partículas asegura que a fase sólida non sae da columna coa fase líquida.
As columnas de afinidade poden ser eluídas cambiando as concentracións de sales, pH, pI, carga e forza iónica directamente ou por medio dun gradiente para resolver as partículas de interese.
Máis recentemente, desenvolvéronse equipos que empregan máis dunha columna en serie. A vantaxe comparada cos equipos dunha soa columna é que o material de resina pode cargarse completamente, xa que ningún produto non unido pasa directamente á columna seguinte co material da columna fresco. Estes procesos cromatográficos coñécense como cromatografía contracorrente periódica (PCC). Os custos da resina por cantidade de produto producido poden así ser reducidos drasticamente. Como unha columna pode sempre ser eluída e rexenerada mentres que se carga a outra columna, dúas columnas son xa suficientes para facer uso completo das vantaxes. As columnas adicionais poden dar unha flexibilidade adicional para os tempos de rexeneración e a elución, pero cun custo de equipamento adicional e os custos da resina.
Usos específicos
A cromatografía de afinidade pode ser utilizada en varias aplicacións, como a purificación de ácidos nucleicos, purificación de proteínas a partir de extractos de células ou a partir do sangue.
Usando a cromatografía de afinidade, pódense separar proteínas que se unen a certos fragmentos, doutras proteínas que non se unen a ditos fragmentos. Como esta técnica de purificación depende das propiedades biolóxicas das proteínas necesarias, é unha técnica útil e as proteínas poden ser purificadas nun paso.
Medios e afinidade
Existen moitos medios de afinidade diferente para unha variedade de posibles usos. Brevemente e en xeral, estes medios e métodos son:
Activado/Funcionalizado – Funciona como un espazador funcional, matriz de soporte, e elimina a necesidade de manipular reactivos tóxicos. Aminoácido – Usado cunha variedade de proteínas séricas, outras proteínas, péptidos e encimas, así como ARNr e ADN bicatenario. Avidina Biotina – Usado no proceso de purificación de biotina/avidina e os seus derivados. Enlace a carbohidratos – As máis das veces usada con glicoproteínas ou calquera outra substancia que conteña carbohidratos. Carbohidrato – Usada con lectinas, glicoproteínas, ou calquera outra proteína metabolito carbohidrato. Ligando de tinguiduras – Este medio non é específico, pero imita substratos biolóxicos e proteínas. Glutatión – Útil para a separación de proteínas recombinantes etiquetadas con GST (glutatión-S-transferase). Heparina – Este medio é un ligando de afinidade xeneralizado, e é útil principalmente para a separación de proteínas da coagulación do plasma, xunto con ácidos nucleicos, encimas e lipases. Interacción hidrófoba – Usada principalmente cando a diana son grupos carboxilo libres e proteínas. Inmunoafinidade – Detallada máis abaixo, ese método utiliza a alta especificidade de antíxenos e anticorpos para separalos. Cromatografía de Afinidade de Metais Inmobilizados – Detallada máis abaixo, este método usa as interaccións entre ións metálicos e proteínas (xeralmente as que están especialmente etiquetadas) para así separalas. Nucleótido/Coencima – Funciona para separar deshidroxenases, quinases e transaminases. Ácido nucleico – Funciona atrapando ARNm, ADN, ARNr e outros ácidos nucleicos/oligonucleótidos. Proteína A/G – Este método é utilizado para purificar inmunoglobulinas. Especialidade – Deseñada para unha clase específica ou tipo de proteína/coencima, este tipo de medio só funciona para separar unha proteína específica ou coencima.
Inmunoafinidade
Outro uso é a purificación por afinidade dos anticorpos presentes no soro sanguíneo. Se o soro se sabe que contén anticorpos contra un antíxeno específico (por exemplo se o soro procede dun organismo inmunizado contra o antíxeno en cuestión) despois pode usarse para a purificación por afinidade dese antíxeno. Isto tamén se denomina cromatografía de inmunoafinidade. Por exemplo, se un organismo está inmunizado contra a proteína de fusión-GST producirá anticorpos contra a proteína de fusión, e posiblemente anticorpos contra a etiqueta GST (glutatión-S-transferase) tamén. A proteína pode despois ser acoplada covalentemente a un soporte sólido como a agarosa e utilizado como un ligando de afinidade na purificación de anticorpos do soro inmune.