miniatura|upright=1.2|A dihidrofolato redutase de E. coli cos seus dous substratos: dihidrofolato (dereita) e NADPH (esquerda), unidos no sitio activo. A proteína móstrase como un diagrama de fitas, coas hélices alfa en vermello, as follas beta en amarelo e os bucles en azul. () A cinética encimática é o estudo das velocidades de reaccións químicas catalizadas por encimas. Na cinética encimática, mídese a velocidade de reacción e investíganse os efectos de variar as condicións da reacción. Estudar a cinética dun encima desta maneira pode revelar o mecanismo catalítico dese encima, o seu papel no metabolismo, como se controla a súa actividade, e como un fármaco ou un modificador (inhibidor ou activador) poderían afectar a velocidade.
Un encima (E) é unha proteína que funciona como catalizador biolóxico para facilitar e acelerar unha reacción química no corpo. Faino ao unirse a outra molécula, o seu substrato (S), sobre o cal actúa o encima para formar o produto desexado. O substrato únese ao sitio activo do encima para formar o complexo encima-substrato ES, e transfórmase no complexo encima-produto EP e a partir del fórmase o produto P, a través dun estado de transición ES*. Esta serie de pasos coñécese como mecanismo da catálise:
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
Este exemplo é o caso máis simple dunha reacción cun só substrato e un só produto. Tales casos existen: por exemplo, unha mutase como a fosfoglicomutase cataliza a transferencia dun grupo fosfato desde unha posición a outra; este encima pertence ao grupo das isomerases, que é un termo máis xeral para un encima que cataliza calquera reacción de isomerización cun substrato e un produto, como a triosa-fosfato isomerase. Porén, ditos encimas non son moi comúns, e son moi superados en número por encimas que catalizan reaccións con dous substratos e dous produtos; entre estes están, por exemplo, as deshidroxenases dependentes de NAD+ como a alcohol deshidroxenase, a cal cataliza a oxidación de etanol polo NAD+. As reaccións con tres ou catro substratos ou produtos son menos comúns, pero tamén hai casos. Non é necesario que o número de produtos sexa igual ao de substratos; por exemplo, a gliceraldehido 3-fosfato deshidroxenase ten tres substratos e dous produtos.
Cando os encimas se unen a múltiples substratos, como a dihidrofolato redutase (mostrada á dereita), a cinética encimática pode tamén mostrar a secuencia na cal se liberan os produtos. Un exemplo de encimas que se unen a un só substrato e liberan múltiples produtos son as proteases, que dividen un substrato proteico en dous produtos polipeptídicos. Outros únense a dous substratos á vez, como a ADN polimerase que enlaza nucleótidos ao ADN. Aínda que estes mecanismos constan a miúdo de series complexas de pasos, hai normalmente un paso que determina a velocidade (limitante) do que depende a cinética global. Este paso limitante da velocidade pode ser unha reacción química ou un cambio conformacional do encima ou os substratos, como os implicados na liberación de produto(s) do encima.
O coñecemento da estrutura do encima é útil para interpretar os datos cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode suxerir como se unen os substratos e produtos durante a catálise; que cambios ocorren durante a reacción; e mesmo o papel exercido por determinados residuos de aminoácidos no mecanismo. Algúns encimas cambian de forma significativamente durante o mecanismo; en tales casos, é útil determinar a estrutura do encima con e sen análogos do substrato unidos que non experimentan a reacción encimática.
Non todos os catalizadores biolóxicos son encimas proteicos, xa que existen tamén catalizadores baseados no ARN como os ribocimas e os ribosomas, que son esenciais en moitas funcións celulares, como o empalme de ARN e a tradución de proteínas. A principal diferenza entre os ribocimas e os encimas é que os catalizadores de ARN están compostos por nucleótidos, mentres que os encimas están compostos de aminoácidos. Os ribocimas tamén realizan un conxunto máis limitado de reaccións, aínda que os seus mecanismos de reacción e cinética poden analizarse e clasificarse polos mesmos métodos.
Principios xerais
miniatura|300px|A medida que se engaden maiores cantidades de substrato á reacción, os sitios de unión de moléculas dispoñibles do encima quedan cheos, e chégase a un límite chamado . Alén dese límite o encima está saturado de substrato e a velocidade da reacción xa non pode incrementarse.
A reacción catalizada por un encima usa exactamente os mesmos reactivos e produce exactamente os mesmos produtos que esa mesma reacción non catalizada. Igual que outros catalizadores, os encimas non alteran o punto de equilibrio entre substratos e produtos. Porén, a diferenza de reaccións químicas catalizadas, as reaccións catalizadas por encimas mostran cinéticas de saturación. Para unha concentración dada de encima e para concentracións relativamente baixas de substrato, a velocidade de reacción increméntase linealmente coa concentración de substrato; as moléculas de encima están en gran parte libres para poder catalizar a reacción, e incrementar a concentración de substrato significa aumentar a velocidade á que as moléculas de encima e as de substrato se encontran unhas con outras. Porén, a concentracións de substrato relativamente altas, a velocidade de reacción aproxímase asintoticamente ao máximo teórico; os sitios activos do encima están case todos ocupados por moléculas de substrato, o que resulta na saturación, e a velocidade da reacción está determinada pola velocidade de recambio intrínseca do encima.Fromm H.J., Hargrove M.S. (2012) Enzyme Kinetics. In: Essentials of Biochemistry. Springer, Berlin, Heidelberg A concentración de substrato que están no punto medio entre estes dous casos limitantes extremos denótase como KM. Deste xeito, KM é a concentración de substrato á cal a velocidade da reacción é a metade da velocidade máxima.
As dúas propiedades importantes da cinética encimática son a facilidade coa cal o encima pode ser saturado cun substrato, e a velocidade máxima que pode acadar. Coñecer estas propiedades indica o que un encima podería facer na célula e pode mostrar como respondería o encima aos cambios desas condicións.
Ensaios encimáticos miniatura|250px|esquerda|Curva do progreso dunha reacción encimática. A pendente no período de velocidade inicial é a velocidade inicial de reacción v. A ecuación de Michaelis–Menten describe como esta pendente varía coa concentración de substrato. Os ensaios encimáticos son procedementos de laboratorio que miden a velocidade das reaccións encimáticas. Como os encimas non se consomen nas reaccións que catalizan, os ensaios encimáticos xeralmente seguen os cambios na concentración dos substratos ou dos produtos para medir a velocidade da reacción. Hai moitos métodos de medida. Os ensaios espectofotométricos observan o cambio na absorbancia de luz entre produtos e reactivos; os ensaios radiométricos implican a incorporación ou liberación de radioactividade para medir a cantidade de produto feito co paso do tempo. Os ensaios espectrofotométricos son os máis convenientes porque permiten medir a velocidade de reacción de forma continua. Aínda que para facer os ensaios radiométricos cómpre retirar e contar as mostras (é dicir, son ensaios descontinuos) adoitan ser extremadamente sensibles e poden medir niveis moi baixos de actividade encimática. Unha estratexia análoga é usar a espectroscopia de masas para monitorizar a incorporación ou liberación de isótopos estables a medida que o substrato é convertido en produto.
Os ensaios de encimas máis sensibles usan láseres enfocados cun microscopio para observar cambios nunha soa molécula de encima a medida que cataliza a súa reacción. Estas medidas poden usar os cambios na fluorescencia de cofactores durante o mecanismo de reacción dun encima, ou de marcadores fluorescentes engadidos a sitios específicos da proteína para informar dos movementos que ocorren durante a catálise. Estes estudos proporcionan unha nova perspectiva da cinética e dinámica dunha soa molécula de encima, o que se diferenza da cinética tradicional, que observa o comportamento medio de poboacións de millóns de moléculas dun encima.
Un exemplo de curva de progreso da reacción para un ensaio encimático é a que se mostra arriba. O encima produce o produto a unha velocidade inicial que é aproximadamente lineal durante un curto período de tempo desde o comezo da reacción. A medida que a reacción avanza e se vai consumindo o substrato, a velocidade decrece continuamente (con tal de que o substrato non estea xa a niveis de saturación). Para medir a velocidade inicial (e a máxima) os ensaios encimáticos lévanse normalmente a cabo mentres a reacción avanzou só unha pequena porcentaxe antes de completarse totalmente. A lonxitude do período de velocidade inicial depende das condicións do ensaio e pode estar dentro dun rango de milisegundos ou horas. Porén, o equipamento necesario para mesturar líquidos rapidamente permite medidas cinéticas rápidas a velocidades iniciais de menos dun segundo. Estes ensaios moi rápidos son esenciais para medir a cinética pre-estado estacionario, que se explican máis abaixo.
A maioría dos estudos de cinéticas encimáticas concéntranse nesta parte inicial e aproximadamente lineal das reaccións encimáticas. Porén, tamén é posible medir a curva de reacción completa e axustar estes datos a unha ecuación de velocidade non lineal. Este xeito de medirmos as reaccións encimáticas chámase análise de curva de progreso da reacción. Este método é útil como alternativa á cinética rápida cando a velocidade inicial é demasiado rápida para medila con precisión.
As directrices dos estándares para o informe de datos encimolóxicos ou STRENDA (do inglés Standards for Reporting Enzymology Data) proporcionan a información mínima necesaria para informar de forma completa de datos cinéticos e de equilibrio de investigacións sobre actividades de encimas, incluíndo as condicións experimentais correspondentes. As directrices foron desenvolvidas para informar de datos de encimas funcionais con rigor e robustez.
Reaccións dun só substrato Entre os encimas con mecanismos nos que intervén un só substrato están as isomerases como as triosa-fosfato isomerase ou a bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como a adenilato ciclase e o ribocima cabeza de martelo, e a ARN liase. Porén, algúns encimas que só teñen un só substrato non entran dentro desta categoría de mechanismo. A catalase é un exemplo disto, xa que o encima reacciona cunha primeira molécula do substrato peróxido de hidróxeno, queda oxidado e é despois reducido por unha segunda molécula de substrato. Aínda que está implicado un só substrato, a existencia dun intermediario encimático modificado significa que o mecanismo da catalase é realmente un mecanismo pimpón, un tipo de mecanismo que é explicado nas reaccións multisubstrato da sección de máis abaixo.
Cinética de Michaelis–Menten
As reaccións catalizadas por encimas son saturables, a súa velocidade de catálise non mostra unha resposta lineal ao incremento de substrato. Se a velocidade inicial da reacción se mide nun rango de concentracións de substrato (denotadas como [S]), a velocidade de reacción inicial () aumenta a medida que se incrementa a [S], como se mostra á dereita. Porén, a medida que [S] se fai máis alta, o encima faise saturado de substrato e a velocidade inicial chega a Vmax, a velocidade máxima do encima.