Este artigo é sobre a técnica de laboratorio. Para os tratamentos médicos ver diálise renal e diálise hepatica. Para o tratamento da auga ver osmose inversa. Para outros usos ver diálise.
miniatura|Diálise de pequenas moléculas usando tubos de diálise En química e bioquímica, a diálise é o proceso de separar moléculas en solución pola diferenza nas súas velocidades de difusión a través dunha membrana semipermeable, como un tubo de diálise.
A diálise é unha técnica de laboratorio común que funciona seguindo o mesmo principio que a diálise médica. No campo da investigación das ciencias da vida, a aplicación máis común da diálise é para a eliminación de moléculas pequenas non desexadas como sales, axentes redutores ou tinturas de grandes macromoléculas como proteínas, ADN ou polisacáridos. A diálise tamén se usa frecuentemente para o intercambio de tampóns e estudos de unión de fármacos.
O concepto de diálise introduciuno en 1861 o químico escocés Thomas Graham. Graham utilizou esta técnica para separar os solutos sacarosa (unha molécula pequena) e goma arábiga (unha molécula grande) en solución acuosa. El chamou aos solutos difusibles cristaloides e aos que non pasaban pola membrana coloides.
A partir deste concepto, a diálise pode definirse como un proceso de separación espontáneo de partículas coloidais suspendidas desde ións disoltos a moléculas de pequenas dimensións a través dunha membrana semipermeable. Unha membrana de diálise está feita normalmente de celulosa, celulosa modificada ou un polímero sintético (acetato de celulosa ou nitrocelulosa).
Etimoloxía O termo diálise deriva do grego , 'a través' e , 'afrouxar, soltar'.
Principios A diálise é o proceso usado para cambiar a matriz de moléculas dunha mostra diferenciando as moléculas clasificándoas por tamaños. Depende da difusión, que é o movemento térmico aleatorio de moléculas en solución (movemento browniano) que causa o movemento neto de moléculas desde unha área de maior concentración a outra de menor concentración ata que se chegue ao equilibrio. Debido ao tamaño de poro da membrana, as moléculas grandes da mostra non poden pasar a través da membrana, o cal restrinxe a súa difusión desde a cámara de mostras. Ao contrario, as moléculas pequenas poden difundir libremente a través da membrana e atinxen o equilibrio en todo o volume da solución, o que cambia a concentración global destas moléculas na mostra e no dializado (ver a figura da diálise á dereita).
A osmose é outro principio que fai que a diálise funcione. Durante a osmose, o fluído móvese desde áreas con maior concentración de auga a través dunha membrana semipermeable ata o equilibrio. Na diálise, o exceso de fluído móvese desde unha mostra ao dializado a través da membrana ata que o nivel de fluído é o mesmo na mostra e no dializado.
Finalmente, a ultrafiltración é o fluxo convectivo de auga e solutos disoltos a favor de gradiente de presión causado por forzas hidrostáticas ou forzas osmóticas. Na diálise a ultrafiltración retira as moléculas de residuos e o exceso de fluído dunha mostra.
Por exemplo, a diálise ocorre cando unha mostra contida nunha bolsa de celulosa se mergulla nunha solución de diálise. Durante a diálise, alcánzase un equilibrio entre a mostra e o dializado, xa que soamente poden pasar pola membrana de celulosa as moléculas pequenas, deixando detrás só as partículas máis grandes.
Unha vez que se chega ao equilibrio, a concentración final de moléculas depende dos volumes das solucións implicadas, e se o dializado equilibrado é substituído (ou intercambiado) cun dializado novo (ver procedemento máis abaixo), a difusión reducirá aínda máis a concentración das pequenas moléculas da mostra.
A diálise pode utilizarse para intoducir ou retirar pequenas moléculas dunha mostra, porque as pequenas moléculas se moven libremente a través da membrana en ambas as direccións. A diálise pode tamén utilizarse para retirar sales. Isto fai que a diálise sexa unha técnica útil para diversas aplicacións. Ver tubo de diálise para máis información sobre a historia, propiedades e fabricación das membranas semipermeables usadas para a diálise.
Tipos
Diálise de difusión A diálise de difusión é un proceso de separación espontánea no cal a forza impulsora que produce a separación é o gradiente de concentración. Ten un incremento de entropía e unha diminución da enerxía libre de Gibbs, o que significa que é termodinamicamene favorable. A diálise de difusión usa membranas de intercambio de anións ou membranas de intercambio de catións dependendo dos compostos que separa. A membrana de intercambio de anións permite o paso de anións á vez que impide o paso de catións debido ao rexeitamento co-iónico e a preservación da neutralidade eléctrica. O oposto ocorre coas membranas de intercambio de catións.
Electrodiálise A electrodiálise é un proceso de separación que usa membranas de intercambio iónico e un potencial eléctrico como forza impulsora. Utilízase maiormente para retirar ións de solucións acuosas. Hai tres procesos de electrodiálise que se utilizan comunmente: diálise de Donnan, electrodiálise inversa e electro-electrodiálise. Estes procesos explícanse seguidamente.
Diálise de Donnan
A diálise de Donnan é proceso de separación que se usa para intercambiar ións entre dúas solucións acuosas que están separadas por membranas de intercambio de catións ou de anións. No caso dunha membrana de intercambio de catións que separa dúas solucións con diferente acidez, os protóns (H+) pasan a través da membrana ao lado menos ácido. Isto induce un potencial eléctrico que causa un fluxo dos catións presentes no lado menos ácido cara ao lado máis ácido. O proceso acaba cando a variación da concentración de H+ é da mesma orde de magnitude que a diferenza de concentraión dos catións separados.
Electrodiálise inversa A electrodiálise inversa é unha tecnoloxía baseada en membranas que obtén electricidade dunha mestura de dúas correntes de auga con diferentes salinidades. Normalmente usa membranas de intercambio de anións ou de catións. As membranas de intercambio de anións utilízanse para deixar pasar os anións e impedir o paso de catións, e as membranas de intercambio de catións, para todo o contrario. Os catións e anións na auga de alta salinidade móvense cara á auga de menor salinidade, pasando os catións a través das membranas de intercambio catiónico e os anións a través das de intercambio aniónico. Este fenómeno pode converterse en electricidade.
Electro-electrodiálise A electro-electrodiálise é un proceso de electromembranas que utiliza tres compartimentos, que combinan a electrodiálise e a electrólise. Adoita utilizarse para recuperar ácido dunha disolución usando membranas de intercambio aniónico e catiónico e electrólise. Os tres compartimentos están separados por dúas barreiras, que son as membranas de intercambio iónico. O compartimento do medio contén a auga que vai ser tratada. Os compartimentos localizados aos lados conteñen auga pura. Os anións pasan a través da membrana de intercambio aniónico, mentres que os catións pasan pola de intercambio catiónico. A electricidade crea H+ no lado aniónico e OH− no catiónico, que reaccionan cos ións respectivos.
Procedemento
Equipo A separación de moléculas nunha solución é un proceso relativamente directo. Ademais do lisado e do tampón de dializado, todo o que normalmente se necesita é: Unha membrana de diálise do formato axeitado (por exemplo, tubos, casetes etc.) e un límite de peso molecular. Un recipiente para conter o tampón de dializado. A capacidade de remexer as solucións e controlar a temperatura.
Protocolo xeral Un procedemento de diálise típico para mostras de proteínas é o seguinte: Preparar a membrana de acordo coas instrucións. Cargar a mostra no tubo de diálise, casete ou aparello. Situar a mostra nunha cámara externa de tampón de diálise (remexendo suavemente o tampón). Dializar durante dúas horas (á temperatura dunha habitación ou 4 °C). Cambiar o tampón de diálise e dializar durantes outras dúas horas. Cambiar o tampón de diálise e dializar por dúas horas máis ou toda a noite.
O volume total da mostra e do dializado determina a concentración de equilibrio final das pequenas moléculas a ambos os lados da membrana. Usando o volume apropiado de dializado e varios cambios do tampón, a concentración dos pequenos contaminantes da mostra pode descender ata niveis aceptables ou insignificantes. Por exemplo, cando se dializa 1 mL de mostra fronte a 200 mL de dializado, a concentración de substancias dializables indesexadas diminúe ata facerse 200 veces menor cando se atinxe o equilibrio. Despois de dous cambios de tampón adicionais de 200 mL cada un, o nivel de contaminantes na mostra redúcese nun factor de 8 millóns (200 x 200 x 200).
Optimización do protocolo e variables Aínda que dializar unha mostra é relativamente simple, non se pode proporcionar un procedemento de diálise universal para todas as aplicacións debido ás seguintes variables: O volume de mostra. O tamaño das moléculas que hai que separar. A membrana utilizada. A xeometría da membrana, que afecta a distancia de difusión.
Adicionalmente, o punto final da diálise é algo subxectivo e específico da aplicación. Xa que logo, o procedemento xeral podería ncesitar unha optimización para cada caso.
Membranas de diálise e límite de peso molecular
As membranas de diálise prodúcense e caracterízanse segundo os seus límites de peso molecular (LPM ou MWCO na literatura inglesa). Aínda que se dispón comercialmente de membranas con límites que van de 1-1.000.000 kDa, as membranas máis usadas son as que teñen límites de case 10 kDa. O límite de peso molecular dunha membrana é o resultado do número e tamaño medio dos poros creados durante a produción da membrana de diálise. O límite de peso molecular xeralmente refírese á menor masa molecular media dunha molécula estándar que non poderá difundir a través da membrana durante unha diálise prolongada. Así, unha membrana de diálise cun límite de 10 K xeralmente retén máis do 90 % dunha proteína que teña unha masa molecular de polo menos 10 kDa.
Cómpre sinalar que o límite de peso molecular dunha membrana non é un valor definido nitidamente. As moléculas con masa preto do límite da membrana difunden a través da mesma máis lentamente que as moléculas significativamente máis pequenas. Para que unha molécula difunda rapidamente a través dunha membrana, normalmente necesitará ser polo menos de 20 a 50 veces máis pequena que o límite de peso molecular desa membrana. Por tanto, non é práctico separar unhas proteínas de 30 kDa dunhas proteínas de 10 kDa usando diálise a través dunha membrana de diálise de 20 K.
As membranas de diálise para laboratorio están feitas normalmente dunha película de celulosa rexenerada ou ésteres de celulosa. Ver referencia para unha revisión das membranas de celulosa e da súa fabricación.
Formatos de diálise de laboratorio A diálise realízase xeralmente en bolsas con clip de tubo de diálise ou en divesos tipos de dializadores formateados. A elección do equipamento de diálise usado depende en gran medida do tamaño da mostra e a preferencia do usuario. Os tubos de diálise son os formatos máis vellos e xeralmente máis baratos utilizados para diálise no laboratorio. Os tubos córtanse e sélanse cun clip nun dos extremos, despois énchense e sélanse cun clip no outro extremo. Os tubos proporcionan flexibilidade, pero poden ter problemas de manexo, selado e recuperación da mostra. Os tubos de diálise subministranse húmidos ou secos en rolos ou tubos telescópicos pregados.