miniatura|200px|dereita|Replicación do ADN. A dobre hélice desenrólase e cada febra actúa como un molde para a seguinte febra. As bases aparéanse para sintetizar as novas febras fillas. A replicación do ADN é o proceso de producir dúas réplicas idénticas a partir dunha molécula orixinal de ADN. Este proceso biolóxico ocorre en todos os organismos vivos e é a base da herdanza biolóxica. Na replicación interveñen moitos encimas. O ADN está constituído por dúas febras e cada febra da molécula de ADN orixinal serve como molde para a produción da febra complementaria, un proceso denominado replicación semiconservadora (ou semiconservativa), polo cal cada molécula replicada conserva unha febra orixinal e leva unha febra sintetizada nova. Os mecanismos celulares de corrección de probas e de comprobación de erros aseguran que a replicación se realice cunha fidelidade case perfecta. Unha replicación imperfecta do ADN dá lugar a mutacións.
Na célula, a replicación do ADN empeza en lugares específicos do xenoma chamados orixes de replicación. O desenrolamento do ADN nas orixes de replicación e a síntese de novas febras forma dúas forquitas de replicación que crecen de forma bidireccional desde a orixe. Diversas proteínas que están asociadas á forquita de replicación axudan na iniciación e continuación da síntese do ADN. A máis salientable delas é a ADN polimerase, que sintetiza o novo ADN engadindo nucleótidos complementarios aos da febra molde.
A replicación do ADN pode tamén realizarse in vitro (artificialmente, fóra da célula). Poden utilizarse as ADN polimerases illadas das células e os cebadores (primers) de ADN artificiais para iniciar a síntese de ADN en secuencias coñecidas dunha molécula de ADN molde. A reacción en cadea da polimerase (PCR), que é unha técnica de laboratorio moi común, aplica ciclicamente a síntese artificial para amplificar a cantidade de copias dun fragmento de ADN diana específico entre un conxunto de ADNs.
Estruturas do ADN
O ADN normalmente ten unha estrutura bicatenaria na que as dúas cadeas ou febras se trenzan entre si formando a característica dobre hélice. Cada febra do ADN é unha cadea formada por catro tipos de nucleótidos, cada un dos cales contén o azucre desoxirribosa, un fosfato, e unha base nitroxenada ou nucleobase (hai catro: adenina, citosina, guanina, e timina, abreviadas como A, C, G e T). A adenina e guanina do ADN son purinas, mentres que a citosina e a timina son pirimidinas. Estes nucleótidos forman enlaces fosfodiéster, creando o esqueleto desoxirribosa-fosfato da dobre hélice do ADN, mentres que as nucleobases están situadas na parte interior da hélice. As bases dos nucleótidos son complementarias coas da febra oposta e enlázanse coas de enfronte por pontes de hidróxeno para formar pares de bases. Os pares son A=T (con dúas pontes de hidróxeno), e C≡G (con tres pontes de hidróxeno).
As febras de ADN teñen unha direccionalidade, e os dous extremos dunha febra monocatenaria denomínanse "extremo 3' (tres prima)" e "extremo 5' (cinco prima)". Por convención, se se dá a secuencia de bases dunha febra monocatenaria do ADN, o extremo esquerdo da secuencia é o 5', e á dereita estará o extremo 3'. As febras dunha dobre hélice son antiparalelas, e unha delas vai de 5' a 3' mentres que a febra oposta vai de 3' a 5'. Os números destes termos refírense ao átomo de carbono da desoxirribosa ao cal se une o seguinte fosfato da cadea. A direccionalidade ten consecuencias na síntese de ADN, porque a ADN polimerase só pode sintetizar o ADN nunha dirección engadindo nucleótidos ao extremo 3' dunha febra de ADN (a síntese do ADN é en dirección 5'-3').
O apareamento de bases complementarias no ADN por medio de pontes de hidróxeno significa que a información contida en cada febra é redundante. Os nucleótidos dunha febra sinxela poden utilizarse para reconstruír nucleótidos sobre a febra de nova síntese complementaria.Alberts, B., et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 4th ed., 2002, pp. 238–240 ISBN 0-8153-3218-1
ADN polimerase
miniatura|250px|dereita| As ADN polimerases engaden nucleótidos ao extremo 3' dunha febra de ADN.Allison, Lizabeth A. Fundamental Molecular Biology. Blackwell Publishing. 2007. p.112 ISBN 978-1-4051-0379-4 Se por accidente se incorpora un nucleótido non complementario, a polimerase queda inhibida para continuar a extensión da febra. A actividade de corrección de probas elimina o nucleótido non complementario e a extensión da febra continúa.
As ADN polimerases son unha familia de encimas que levan a cabo todas as formas de replicación do ADN. Chapter 27, Section 2: DNA Polymerases Require a Template and a Primer As ADN polimerases en xeral non poden iniciar a síntese de novas febras partindo de cero, senón que só poden estender unha febra de ADN ou ARN xa existente apareada cunha febra molde. Para empezar a síntese, debe crearse un curto fragmento de ARN, chamado cebador ou primer, que se aparea coa febra molde do ADN.
A ADN polimerase engade unha nova febra de ADN estendendo o extremo 3' dunha cadea de nucleótidos existente, engadindo a ela un a un novos nucleótidos que son complementarios cos da febra molde por medio da creación de enlaces fosfodiéster. Os nucleótidos necesarios chegan á zona de síntese do ADN en forma de nucleósidos trifosfato, pero incorpóranse ao ADN en forma de nucleótidos (monofosfato). Precisamente, a enerxía para este proceso de polimerización do ADN procede da hidrólise dos enlaces fosfoanhidro de fosfato de alta enerxía entre os tres fosfatos dos nucleósidos trifosfato. (propiamente falando os nucleótidos teñen un só fosfato, e se teñen máis denomínanse nucleósidos difosfato ou trifosfato). Cando se engade un nucleótido a unha febra de ADN en crecemento, a formación dun enlace fosfodiéster entre o fosfato proximal do nucleótido á cadea en crecemento vai acompañado da hidrólise dun enlace de alta enerxía coa liberción dos dous fosfatos distais en forma de pirofosfato. A hidrólise encimática do pirofosfato resultante en dous fosfatos inorgánicos separados consome un segundo enlace fosfato de alta enerxía e fai que a reacción sexa irreversible.A enerxética deste proceso pode tamén axudar a explicar a direccionalidade da síntese. Se o ADN fose sintetizado en dirección 3' a 5', a enerxía para este proceso viría do extremo 5' da febra en crecemento en vez de dos nucleósidos trifosfato libres. O problema é que se os trifosfatos de alta enerxía estivesen na febra en crecemento e non nos nucleósidos libres, a corrección de probas feita liminando un nucleótido terminal mal apareado faríase problemática: Unha vez que se engade un nucleótido, pérdese o trifosfato e só queda un só fosfato no esqueleto da molécula entre o novo nucleótido e o resto da febra. Se o nucleótido engadido estivese erradamente apareado, a súa eliminación tería como resultado unha febra de ADN que remata nun monofosfato no extremo da "febra en crecemento" en vez dun trifosfato de alta enerxía. Deste modo a febra quedaría bloqueada e non podería xa crecer máis. En realidade, o que ocorre é que os trifosfatos de alta enerxía hidrolizados en cada paso da síntese se orixinan a partir de nucleósidos trifosfato libres, e non da febra polimerizada, polo que este problema non existe.
En xeral, as ADN polimerases son moi exactas na súa actividade de replicación, e teñen unha taxa de erro intrínseca de menos dun erro por cada 107 nucleótidos engadidos. Ademais, algunhas ADN polimerases teñen tamén unha capacidade de corrección de probas, polo que poden quitar nucleótidos do extremo dunha febra en crecemento para corrixir as bases mal apareadas. Finalmente, os mecanismos de reparación de erros de apareamento post-replicación revisan os erros que poida ter o ADN, e son quen de distinguir erros de apareamento que hai na febra de nova síntese con respecto á secuencia da febra orixinal. En conxunto, estes tres pasos de discriminación permiten unha fidelidade de replicación de menos dun erro por cada 109 nucleótidos engadidos.
A taxa de replicación do ADN nunha célula viva foi medido como a taxa de elongación do ADN do fago T4 na bacteria Escherichia coli infectada polo fago. Durante o período de incremento de ADN exponencial a 37 °C, a velocidade é de 749 nucleótidos por segundo. A taxa de mutación por par de bases por replicación durante a síntese do ADN do fago T4 é de 1,7 por 108.Drake JW (1970) The Molecular Basis of Mutation. Holden-Day, San Francisco ISBN 0-8162-2450-1 ISBN 978-0-8162-2450-0 Esta replicación é, pois, abraiantemente rápida e exacta.
Replicación semiconservadora
miniatura|dereita|300px|Representación gráfica das tres hipóteses sobre a replicación do ADNa) Conservadora b) Dispersantec) Semiconservadora.
Na década de 1950 había tres hipóteses sobre a replicación do ADN en canto á conservación das febras orixinais nas moléculas replicadas. Estas hipóteses eran as seguintes:
Hipótese semiconservadora ou semiconservativa (modelo aceptado hoxe). En cada unha das moléculas replicadas consérvase unha das febras completas orixinais, mentres que a outra febra é de nova síntese. Hipótese conservadora ou conservativa. Sintetízase unha molécula totalmente nova (coas dúas febras de nova síntese), copia da orixinal. Hipótese dispersante ou dispersiva. As cadeas replicadas constan de fragmentos da cadea antiga e de fragmentos de nova síntese.
O experimento de Meselson e Stahl realizado na bacteria Escherichia coli en 1958 demostrou que a hipótese correcta era a semiconservadora, é dicir, cada molécula de ADN replicada ten unha febra completa orixinal e unha febra completa de nova síntese.
Proceso de replicación
A replicación do ADN, como todos os procesos de polimerización biolóxica, ten lugar por medio de tres etapas coordinadas e catalizadas encimaticamente, que son: iniciación, elongación e terminación.
Iniciación miniatura|200px|dereita|Papel dos iniciadores na iniciación da replicación do ADN. miniatura|200px|Formación do complexo de pre-replicación. Para que se divida unha célula debe primeiro replicarse o seu ADN. Chapter 5: DNA Replication Mechanisms Este proceso iníciase en puntos concretos do ADN chamados orixes de replicación, que son a diana de certas proteínas iniciadoras. En E. coli esta proteína é DnaA (escrito con minúscula); en lévedo, é o complexo de recoñecemento da orixe. As secuencias usadas como dianas polas proteínas iniciadoras adoitan ser ricas en AT (adenina e timina), porque os pares A-T teñen dúas pontes de hidróxeno (en vez das tres que forman a unión máis forte do par CG), polo que son fáciles de romper para abrir nese punto o ADN como unha cremalleira.12.1. General Features of Chromosomal Replication: Three Common Features of Replication Origins Unha vez que se localiza a orixe, estes iniciadores recrutan outras proteínas e forman o complexo de pre-replicación, que desenrola o ADN bicatenario. A partir da orixe fórmanse dúas forquitas de replicación que avanzan en direccións opostas, polo que a replicación é bidireccional. A zona entre estas dúas forquitas denomínase burbulla de replicación.
Elongación A ADN polimerase ten unha actividade 5'-3'. Todos os sistemas de replicación do ADN coñecidos requiren un grupo 3'-hidroxilo libre para que se poida iniciar a síntese (Nota: o ADN é lido en dirección 3' a 5' mentres que a nova febra sintetízase na dirección 5' a 3'). Distínguense catro mecanismos de iniciación da síntese, que son: Todas as formas de vida celulares e moitos virus de ADN, fagos plásmidos usan unha encima primase para sintetizar un curto cebador de ARN cun grupo 3'-OH que despois vai ser elongado por unha ADN polimerase. Os retroelementos (como os retrovirus) empregan un ARN de transferencia que ceba a replicación do ADN ao proporcionar un 3′-OH libre que se utiliza para a elongación pola transcriptase inversa.