miniatura|upright=2.0|dereita|Esquema da introdución por un lentivirus dun shRNA (small hairpin RNA) deseñado e o mecanismo da interferencia de ARN en células de mamíferos. A interferencia de ARN ou interferencia por ARN ou ribointerferencia, abreviada como RNAi (do inglés RNA interference), é un sistema celular que intervén no control da inactivación dos xenes e do seu grao de expresión, que é realizado por certos tipos de ARN, chamados ARN interferentes. Por tanto, cómpre distinguir entre: Interferencia de ARN (ou RNAi, RNA interference). É o proceso biolóxico antes mencionado. ARN interferentes (ou iRNA, interferring RNA). Son certos tipos de ARN encargados de realizar ese proceso biolóxico.
Historicamente a interferencia de ARN foi coñecida tamén con outros nomes, como cosupresión, silenciamento de xenes postranscricional (PTGS), e quelling.
Hai dous tipos de moléculas de ARN pequenas, o microARN (miRNA) e o ARN interferente pequeno (siRNA), que son básicos na interferencia de ARN. Outro tipo de ARN interferente é o piRNA (asociado ás proteínas piwi). Os ARN son un produto directo da transcrición de xenes, e estes pequenos ARN poden unirse a outros ARN específicos (ARNm) facendo que aumenten ou diminúan a súa actividade; por exemplo impedindo que o ARNm sexa traducido a proteínas. A interferencia de ARN ten un importante papel na defensa das células contra xenes parasitos, como virus e transposóns, pero tamén dirixen o desenvolvemento celular e a expresión xenética en xeral.
A vía da interferencia de ARN (RNAi) está presente nos animais e en moitos eucariotas e iníciase polo encima Dicer, que corta os ARN de dobre cadea (dsRNA, double stranded RNA) longos en fragmentos máis curtos de ~20 nucleótidos que se chaman siRNA. Cada siRNA sepárase en dúas cadeas de ARN monocatenarias (ssRNA, single stranded RNA), que se denominan a fibra pasaxeira e a fibra guía. A fibra pasaxeira será degradada, e a fibra guía será incorporada no chamado complexo silenciador inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex). O fenómeno de interferencia mellor estudado é o silenciamento de xenes postranscricional, que ocorre cando a fibra guía se une por apareamento de bases cunha secuencia complementaria dunha molécula de ARN mensaxeiro e induce o seu corte pola Argonauta, o compoñente catalítico do complexo RISC. Este proceso sábese que se propaga sistemicamente a través do organismo a pesar da limitada concentración molar inicial do siRNA.
O efecto selectivo e potente da interferencia de ARN (RNAi) sobre a expresión xénica fai deste proceso unha ferramenta valiosa para a investigación tanto en cultivos celulares coma nos organismos vivos, porque os ARN de dobre cadea introducidos nas células poden inducir a supresión dos xenes específicos que interesen. A interferencia (RNAi) pode tamén utilizarse en exames a grande escala que bloqueen sistematicamente a expresión de cada xene dunha célula, o cal pode axudar a identificar os compoñentes que se precisan para cada proceso celular ou para procesos complexos como a división celular. O aproveitamento desta vía é tamén unha ferramenta moi prometedora en biotecnoloxía e medicina.
Historicamente, a interferencia de ARN era coñecida por outros nomes, como cosupresión, silenciamento de xenes postranscricional, e sufocamento (quelling). Só despois de que se comprendesen ben estes procesos aparentemente non relacionados quedou claro que todos eles describían o mesmo fenómeno, a interferencia de ARN (RNAi). En 2006, Andrew Fire e Craig C. Mello compartiron o Premio Nobel de Medicina e Fisioloxía polos seus traballos publicados en 1998 sobre a interferencia de ARN no verme nematodo Caenorhabditis elegans .
Mecanismo celular miniatura|dereita|A proteína Dicer do protozoo Giardia intestinalis, que cataliza o corte dos dsRNA a siRNA. Os dominios ARNase están coloreados en verde, o dominio PAZ en amarelo, o dominio plataforma en vermello, e a hélice conectora en azul.
A RNAi é un proceso de silenciamento de xenes dependente do ARN que está controlado polo complexo silenciador inducido por ARN (RISC) e é iniciado por moléculas curtas de ARN de dobre cadea (dsRNA) no citoplasma celular, onde interaccionan co compoñente catalítico de RISC, chamado Argonauta. Cando o ARN bicatenario (dsRNA) é de procedencia exóxena (procede da infección dun virus con xenoma de ARN ou de manipulacións de laboratorio), o ARN impórtase directamente ao citoplasma e córtase en fragmentos polo encima Dicer. Pero o dsRNA iniciador pode ser tamén endóxeno (orixinado dentro da célula), como pode ser un pre-microARN expresado a partir dun xene codificante de ARN do xenoma. Os transcritos primarios de cada xene son primeiro procesados para formar a característica estrutura de talo-bucle dos pre-microARN que se encontran no núcleo celular, despois son exportados ao citoplasma para ser escindidos por Dicer. Así, as dúas vías do ARN de dobre cadea, exóxena e endóxena, converxen no complexo RISC.
Escisión dos ARN bicatenarios Os ARN bicatenarios endóxenos inician a interferencia de ARN activando a ribonuclease Dicer, que se une e corta os ARN de dobre cadea (dsRNA), orixinando fragmentos de dobre cadea de 20–25 pares de bases con 2 nucleótidos máis que sobresaen nos extremos 3'. Estudos bioinformáticos dos xenomas de múltiples organismos suxiren que esta lonxitude maximiza a especificidade co xene diana e minimiza os efectos non específicos. Estes curtos fragmentos de ARN bicatenario denomínanse ARN interferentes pequenos (siRNA). Estes siRNA son despois separados en moléculas monocatenarias e integradas nun complexo RISC activo. Despois da integración no RISC, os siRNA únense por apareamento de bases complementarias ao seu ARNm diana e inducen o corte de dito ARNm, impedindo dese modo que poida ser utilizado como molde para a tradución de proteinas.
Os ARN de dobre cadea exóxenos son detectados por unha proteína efectora que se une a eles, chamada RDE-4 no verme Caenorhabditis elegans e R2D2 na mosca Drosophila, que estimula a actividade de Dicer. Esta proteína só se une a ARN bicatenarios longos, mais o mecanismo que determina esta especificidade de tamaño é descoñecido. Esta proteína de unión ao ARN entón facilita a transferencia dos siRNA cortados ao complexo RISC.
En C. elegans, esta resposta de iniciación amplifícase por medio da síntese dunha poboación de siRNA "secundarios" durante a cal os siRNA iniciadores producidos polo Dicer ou siRNA "primarios" son utilizados como moldes. Estes siRNA "secundarios" son estruturalmente distintos dos producidos polo Dicer e parece que son producidos por unha ARN polimerase dependente de ARN (RdRP).
MicroARN miniatura|dereita|Estrutura secundaria en talo-bucle dun pre-microARN da planta Brassica oleracea.
Os microARN (miARN) son ARN non codificantes (non codifican proteínas) codificados xenomicamente (transcríbense de xenes do xenoma) que axudan a regular a expresión xénica, particularmente durante o desenvolvemento. O fenómeno da interferencia de ARN (RNAi), definida de modo xeral, inclúe os efectos de slenciamento de xenes inducidos endoxenamente polos miRNA e tamén o silenciamento desencadeado polos ARN de dobre cadea alleos. Os microARN maduros son estruturalmente similares aos siRNA producidos a partir de ARN bicatenario exóxeno, pero antes de chegaren á súa maduración, os microARN deben primeiro sufrir unha extensa modificación postranscricional. Un microARN exprésase a partir dun xene codificante de ARN moito mís longo como un transcrito primario coñecido como pri-miRNA que é despois procesado polo complexo microprocesador no núcleo celular, orixinando unha estrutura talo-bucle de 70 nucleótidos chamada pre-miRNA. Este complexo consta dun encima RNase III chamado Drosha e unha proteína de unión a ARN bicatenarios chamada Pasha. A porción de dsRNA deste pre-miRNA únese a Dicer, que a corta producindo a molécula madura de microARN que pode integrarse no complexo RISC; deste xeito, os microARN e os siRNA comparten a mesma maquinaria celular nas fases posteriores ao seu procesamento inicial.
Os siRNA derivados de precursores longos de ARN bicatenario (dsRNA) difiren dos microARN en que os microARN, especialmente os de animais, presentan normalmente unha complementariedade de bases incompleta coa súa diana e inhiben a tradución de moitos ARNm diferentes que teñan secuencias similares. Polo contrario, os siRNA normalmente teñen unha complementariedade de bases perfecta e inducen a escisión dun só ARNm diana específico. En Drosophila e C. elegans, os microARN e os siRNA son procesados por distintas proteínas Argonauta e encimas Dicer.
miniatura|esquerda|300px|Esquerda: Un proteína argonauta completa da arquea Pyrococcus furiosus. Dereita: O dominio PIWI dunha proteína argonauta formando un complexo con ARN de dobre cadea.
Activación do RISC e catálise Os compoñentes activos do complexo silenciador inducido por ARN (RISC) son unhas endonucleases chamadas proteínas argonauta, que cortan a cadea de ARNm diana complementaria en bases do siRNA que se une a ela. Como os fragmentos producidos por Dicer son de dobre cadea, poderían en teoría producir cada unha un siRNA funcional. Porén, só unha das dúas cadeas, a denominada fibra ou cadea guía, se une á proteína argonauta e dirixe o silenciamento xénico. A outra, chamada fibra ou cadea anti-guía ou cadea pasaxeira é degradada durante a activación do RISC. Aínda que se cría inicialmente que unha helicase dependente do ATP separaba estas dúas cadeas, en realidade o proceso é independente do ATP e é realizado directamente polos compoñentes proteicos de RISC. A cadea seleccionada como guía tende a ser aquela cuxo extremo 5' está apareado de forma menos estable co seu complemento, pero a selección da cadea non se ve afectada pola dirección na que Dicer corta o ARN bicatenario antes da incorporación de RISC. En vez diso, a proteína R2D2 pode servir como o factor de diferenciación ao unirse o extremo 5', máis estable, da cadea pasaxeira.
A base estrutural da unión do ARN á proteína argonauta foi examinada por cristalografía de raios X do dominio de unión dunha proteína argonauta unida a ARN. Nel, o extremo 5' fosforilado da cadea de ARN entra nun sitio de unión de superficie básica conservado e toma contacto por medio dun catión divalente (con dúas cargas positivas) como o magnesio e por empillamento (stacking) aromático (un proceso que permite que máis dun átomo comparta un mesmo electrón) entre o nucleótido 5' do siRNA e un residuo conservado de tirosina da proteína. Este sitio crese que forma un sitio de nucleación para a unión do siRNA ao seu ARNm diana.
Non se comprende como o complexo RISC activado localiza os ARNm complementarios na célula. Aínda que se propuxo que o proceso de corte está ligado á tradiución, a tradución do ARNm diana non é esencial para a degradación mediada por interferencia de ARN (RNAi). De feito, a RNAi pode ser máis efectiva contra os ARNm diana que non son traducidos. As proteínas argonauta, o compoñente catalítico do RISC, están localizadas en rexións específicas do citoplasma chamadas corpos P (tamén denominados corpos citoplasmáticos ou corpos GW), que son rexións con alto grao de degradación de ARNm; a actividade dos microARN está tamén agrupada nos corpos P. A distorsión dos corpos P fai decrecer a eficiencia da interferencia de ARN, o que suxire que son o lugar onde se produce unha fase crítica do proceso da interferencia (RNAi). miniatura|350px|esquerda|O encima Dicer corta en cachos o ARN de dobre cadea, para formar o ARN interferente pequeno ou o microARN. Estes ARN procesados son incorporados no complexo silenciador inducido por ARN (RISC), que ten como diana o ARN mensaxeiro para impedir a tradución.
Silenciamento transcricional