A proteína fluorescente verde (GFP, do inglés Green Fluorescent Protein) é unha proteína que presenta unha brillante fluorescencia verde cando se expón á luz no espectro que vai do azul ao ultravioleta. A proteína fluorescente verde tradicional é a que primeiro se illou procedente da medusa Aequorea victoria, á que lle dá bioluminescencia, aínda que se encontran proteínas fluorescentes verdes en moitos outros organismos mariños.
En bioloxía celular e molecular, o xene GFP utilízase frecuentemente como un reporteiro da expresión xénica (a súa fluorescencia é indicativa da expresión do xene considerado). Na súa forma modificada foi utilizado para preparar biosensores, e creáronse moitos animais que expresaban a GFP como unha proba experimental de que un xene introducido pode expresarse nun organismo dado. O xene GFP pode introducirse nun organismo e manterse no seu xenoma por medio de cruzamentos, inxección por un vector viral, ou transformación celular. Ata agora, o xene GFP foi introducido e expresado en moitas bacterias, lévedos e outros fungos, peixes (como o peixe cebra), plantas, moscas, e células de mamíferos, incluídas as humanas.
A GFP de Aequorea victoria está composta por 238 residuos de aminoácidos (de 26,9 kDa), e ten o seu maior pico de excitación á lonxitude de onda de 395 nm e outro menor a 475 nm. O seu pico de emisión é a 509 nm, o cal corresponde á porción verde baixa do espectro visible. O rendemento cuántico (QY) de fluorescencia da GFP é de 0,79. A GFP do antozoo Renilla reniformis presenta un só pico maior de excitación a 498 nm.
O Premio Nobel de Química de 2008 outorgóuselles a Martin Chalfie, Osamu Shimomura, e Roger Y. Tsien polo seu descubrimento e desenvolvemento desta proteína fluorescente verde.
Historia
miniatura|200px|Aequorea victoria
GFP de tipo salvaxe (wtGFP) Nas décadas de 1960 e 1970, Osamu Shimomura purificou a GFP e mais outra proteína luminescente distinta, a aequorina, da medusa Aequorea victoria, e estudou as súas propiedades. En A. victoria, a fluorescencia da GFP ten lugar cando a aequorina interacciona con ións Ca2+, inducindo un resplandor azul. Parte desta enerxía luminescente transfírese á GFP, e a cor cambia ao verde. A utilidade desta proteína como ferramenta de bioloxía molecular non empezou a coñecerse ata 1992 cando Douglas Prasher informou da clonación e secuencia de nucleótidos da wtGFP na revista Gene. Cando se esgotaron os orzamentos para ese proxecto de investigación, Prasher enviou mostras de ADNc a varios laboratorios. No laboratorio de Martin Chalfie fixeron que se expresase a secuencia codificante da wtGFP da que se eliminaran algúns dos aminoácidos iniciais, en células heterólogas da bactria E. coli e do nematodo C. elegans, e publicaron os resultados en Science en 1994. Independentemente, no laboratorio de Frederick Tsuji conseguiron a expresión da proteína recombinante un mes despois. A molécula da GFP pregábase e presentaba fluorescencia a temperatura moderada, sen necesidade de cofactores exóxenos específicos da medusa. Aínda que esta proteína case igual á wtGFP era fluorescente, tiña varios inconvenientes, como o espectro de excitación con dous picos, sensibilidade ao pH e ao cloruro, pobre rendemento cuántico de fluorescencia, escasa fotoestabilidade e mal pregamento a 37 °C.
A primeira estrutura cristalina obtida dunha GFP foi a do mutante S65T, traballo feito polo grupo de Remington publicado en Science en 1996. Un mes despois, independentemente, o grupo de Phillips informou da estrutura do tipo salvaxe da GFP en Nature Biotech. Estas estruturas cristalinas proporcionaron información vital sobre a formación dos cromóforos e as interaccións entre os residuos veciños. Os investigadores modificaron estes residuos por mutaxénese dirixida e aleatoria para producir a ampla variedade de derivados da GFP que se usan hoxe. Martin Chalfie, Osamu Shimomura e Roger Y. Tsien compartiron o Premio Nobel de Química de 2008 polo seu descubrimento e desenvolvemento da proteína fluorescente verde.
Derivados da GFP miniatura|200px|A diversidade de mutacións xenéticas ilústase con esta escena de praia debuxada usando bacterias vivas que expresan proteínas fluorescentes de 8 cores distintas (derivadas da GFP e dsRed). Debido ao grande potencial da expansión do uso desta proteína e das necesidades cambiantes dos investigadores, houbo que producir por enxeñaría moitos mutantes distintos da GFP. O primeiro avance importante foi unha mutación nun só punto (a S65T) obtida en 1995 por Roger Tsien. Esta mutación mellorou drasticamente as características espectrais da GFP, o que deu lugar a un incremento da súa fluorescencia, fotoestabilidade, e un cambio do maior pico de excitación a 488 nm, mentres que o pico de emisión se mantivo en 509 nm. Isto correspondíase coas características espectrais dos filtros de FITC normalmente dispoñibles, o que incrementaba a utilidade práctica do uso polos investigadores. En 1995 descubriuse nos laboratorios de Thatsrup e Falkow un mutante con eficiencia de pregamento a 37 °C (F64L) para este armazón que orixina unha GFP potenciada (EGFP, enhanced GFP). A EGFP permitiu o uso práctico das GFPs en células de mamífero. A EGFP ten un coeficiente de extinción (designado ε) de 55.000 M−1cm−1. O rendemento cuántico de fluorescencia (QY) da EGFP é de 0,60. O brillo relativo, expresado como ε•QY, é de 33.000 M−1cm−1. En 2006 obtívose unha GFP con superpregamento (superfolder), cunha serie de mutacións que permiten que a GFP sufra un rápido pregamento e maduración mesmo cando se fusiona con péptidos que se pregan mal.
Realizáronse outras moitas mutacións, incluíndo mutantes da cor; en especial, os derivados proteína fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteína fluorescente ciano (ECFP, Cerulean, CyPet), e proteína fluorescente amarela (YFP, Citrine, Venus, YPet). Os derivados BFP (excepto mKalama1) conteñen a substitución Y66H. A mutación fundamental nos derivados ciano é a substitución Y66W, que causa que o cromóforo se forme cun compoñente indol en vez de cun fenol. Requírense varias mutacións compensatorias adicionais na estrutura de baril que envolve a proteína para restaurar o brillo deste cromóforo modificado debido ao incremento de tamaño do grupo indol. A lonxitude de onda está corrida ao vermello nos derivados YFP debido á mutación T203Y, e está orixinada por interaccións de apilamento dos electróns π entre o residuo de tirosina substituído e o cromóforo. Estas dúas clases de variantes espectrais empréganse a miúdo en experimentos de transferencia de enerxía de resonancia de Förster (FRET). Os reporteiros da FRET codificados xeneticamente sensibles a moléculas de sinalización celular, como o calcio ou o glutamato, o estado de fosforilación da proteína, a complementación da proteína, a dimerización de receptor, e outros procesos proporcionan lecturas ópticas moi específicas da actividade celular en tempo real.
A mutaxénese semirracional de varios residuos orixinou mutantes sensibles ao pH chamados pHluorinas, e máis tarde pHluorinas supereclípticas. Para visualizar a actividade sináptica das neuronas aproveitando o rápido cambio de pH na fusión de vesículas sinápticas, utilizáronse as pHluorinas etiquetadas a sinaptobrevina.
As versións sensibles aos cambios redox da GFP (roGFP) obtivéronse ao introducir cisteínas na estrutura de barril beta da proteína. O estado redox das cisteínas determina as propiedades de fluorescencia da roGFP.
A nomenclatura das GFPs modificadas é con frecuencia confusa debido ao mapado solapante de varias versións da GFP cun mesmo nome. Por exemplo, mGFP pode referirse a unha GFP cunha palmitoilación N-terminal que fai que a GFP se una ás membranas celulares. Porén, o mesmo termo tamén se usa para referirse a unha GFP monomérica, que se pode obter pola mutación A206K de rotura da interface do dímero. A GFP de tipo salvaxe ten unha feble tendencia á dimerización a concentracións por riba de 5 mg/mL. A mGFP tamén significa "GFP modificada", a cal foi optimizada por intercambio de aminoácidos para a súa expresión estable en células de plantas.
A GFP na natureza O propósito da bioluminescencia e da fluorescencia da GFP nas medusas é descoñecido. A GFP coexprésase coa aequorina en pequenos gránulos arredor da beira da campá da medusa. O pico de excitación secundaria (a 480 nm) da GFP absorbe parte da emisión azul da aequorina, o que lle dá á bioluminescencia un ton máis verde. O residuo de serina 65 do cromóforo da GFP é responsable do espectro de excitación con dous picos da GFP de tipo salvaxe. Está conservado nas tres isoformas clonadas orixinalmente por Prasher. Case todas as mutacións deste residuo consolidan o espectro de excitación nun só pico a 395 nm ou a 480 nm. O mecanismo preciso desta sensibilidade é complexo, pero, parece que implica a doazón dun hidróxeno da serina 65 ao glutamato 222, o cal inflúe na ionización do cromóforo. Como unha soa mutación pode aumentar drasticamente o pico de excitación de 480 nm, facendo que a GFP sexa un compañeiro moito máis eficiente da aequorina, A Aquorea victoria parece que preferiu evolutivamente o menos eficiente espectro de excitación de dous picos. Roger Tsien especulou que a variación da presión hidrostática coa profundidade pode afectar á capacidade da serina 65 de doar un hidróxeno ao cromóforo e cambiar a proporción dos dous picos de excitación. Así, a medusa pode cambiar a cor da súa bioluminescencia coa profundidade. Desgraciadamente, un colapso na poboación de medusas en Friday Harbor, onde a GFP foi descuberta, dificultou un maior estudo do papel da GFP no ambiente natural da medusa.
Outras proteínas fluorescentes A causa da gran variedade de derivados da GFP obtidos por enxeñaría, as proteínas fluorescentes que pertencen a outras familias, como a proteína fluorescente inducible pola bilirrubina UnaG, dsRed, eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP, Dendra, IrisFP e moitas outras, denomínanse ás veces erradamente derivados da GFP. Varias destas proteínas presentan propiedades peculiares como unha emisión corrida ao vermello a 600 nm ou a fotoconversión dun estado que emite en verde a outro que emite en vermello. Estas propiedades son ata agora únicas das proteínas fluorescentes que non son derivados da GFP.
Estrutura A GFP ten unha estrutura típica en barril beta, que consta de once follas β e 6 hélices alfa que conteñen o cromóforo unido covalentemente 4-(p-hidroxibencilideno)imidazolidin-5-ona (HBI) no centro. O HBI non é fluorescente en ausencia do armazón da GFP axeitadamente pregada e está principalmente na forma fenol non ionizada na wtGFP. As cadeas laterais dirixidas cara a dentro do barril inducen reaccións de ciclación específicas no tripéptido Ser65–Tyr66–Gly67 que inducen a ionización do HBI á forma fenolato e a formación do cromóforo. Este proceso de modificación postraducional denomínase maduración. A rede de enlaces de hidróxeno e as interaccións de apilamento de electróns nestas cadeas laterais inflúen na cor, intensidade e fotoestabilidade da GFP e os seus numerosos derivados. A natureza moi empaquetada do barril exclúe as moléculas do solvente (auga), protexendo así a fluorescencia do cromóforo.
miniatura|300px|Moléculas de GFP, unha co baril beta completo e outra cun lado cortado para mostrar o cromóforo (azul e vermello), de PDB 1GFL.miniatura|200px|Diagrama de fitas da GFP (de PDB 1EMA).miniatura|250px|Arte: Escultura de Julian Voss-Andreae baseada na estrutura da GFP (2006) no Friday Harbor Laboratories en San Juan Island (Washington, EEUU), que foi o lugar onde se descubriu a GFP.
Aplicacións
Microscopia de fluorescencia miniatura|200px|Super-resolución conseguida con dúas proteínas de fusión (GFP-Snf2H e RFP-H2A). Estudos de colocalización (2CLM) no núcleo dunha célula de cancro óseo. Localiza 120.000 moléculas na área do ancho de campo (470 µm2).