Il test antigenico rapido (in sigla RAT) per SARS-CoV-2 è un test a flusso laterale utilizzato per rilevare l'infezione da SARS-COV-2 (COVID-19).
Sono veloci da implementare con una formazione minima, offrono vantaggi significativi in termini di costi, costando una frazione di altre forme di test COVID-19 e danno agli utenti un risultato entro 5-30 minuti. Tuttavia, hanno un alto tasso di falsi negativi. I test rapidi per l'antigene sono utilizzati in diversi paesi come parte di test di massa o approcci di screening su tutta la popolazione. Si ritiene che siano preziosi per identificare gli individui che sono asintomatici e che potrebbero potenzialmente diffondere il virus ad altre persone, che altrimenti non saprebbero di essere infette. Questo differisce da altre forme di test COVID-19, come la PCR, che sono generalmente considerati un test utile per gli individui sintomatici, in quanto hanno una maggiore sensibilità e possono identificare più accuratamente i casi.
Descrizione
In poco tempo dall'inizio della pandemia sono stati sviluppati e messi in commercio decine di RAT per la diagnosi del COVID-19. La tecnologia utilizzata, flusso laterale con sandwich a doppio anticorpo, già utilizzata in RAT sviluppati precedentemente per altre patologie, è stata adattata a rilevare le proteine/antigeni del SARS-CoV-2. Di queste la proteina N (nucleocapside) e S (spike) sono le più specifiche e possono essere antigeni bersaglio del test. La maggioranza dei test in commercio rilevano la proteina N presente in maggior quantità nel virione, a fronte della proteina S di cui ce ne sono "solo" 25 per virione. Inoltre la proteina N è stata meno soggetta a mutazioni amminoacidiche nelle varianti del SARS-CoV-2 rispetto alla proteina S, pertanto i RAT hanno una buona sensibilità anche verso le diverse varianti del SḀRS-CoV-2. È possibile una reattività crociata dei RAT per il COVID-19 con il virus SARS-CoV. La tecnica del sandwich a doppio anticorpo consiste nel formare un complesso dove l'antigene viene "intrappolato" tra un anticorpo rivelatore (marcato da un sensore cromatografico) e un anticorpo di cattura. I diversi RAT in commercio possono differire soprattutto nella scelta del sensore cromatografico oltre che nella tecnica utilizzata per validare il test.
Il test antigenico ha il limite di essere un test qualitativo (c'è/non c'è) ma il vantaggio di rilevare solo l'infezione attiva, contrariamente ai test anticorpali che rilevano anche le infezioni precedenti. Un vantaggio intrinseco di un test dell'antigene rispetto a un test degli anticorpi (come i test rapidi degli anticorpi dell'HIV) è che il sistema immunitario può impiegare del tempo per sviluppare anticorpi dopo l'inizio dell'infezione, mentre l'antigene estraneo è presente immediatamente. Sebbene qualsiasi test diagnostico possa avere falsi negativi, questo periodo di latenza può aprire una strada particolarmente ampia per i falsi negativi nei test anticorpali, sebbene le particolarità dipendano dalla malattia e dal test.
Alcuni test antigenici rapidi, attraverso una apparecchiatura per immunofluorescenza, rilevando l'intensità della fluorescenza o della chemilumunescenza, possono fornire una misura quasi quantitativa della carica virale. Il risultato non è propriamente una misura quantitativa, ma una misura qualitativa più accurata e sensibile, quasi a livello di quella ottenibile con i cosiddetti test molecolari.
Il RAT per il COVID-19 è tipicamente un kit corredato daː
un tampone rino-orofaringeo per il prelievo del muco o della saliva, una striscia di nitrocellulosa su cui sono depositati i reagenti (dipstick) all'interno di un contenitore di plastica, chiamato cartuccia o cassetta, con ad una estremità una apertura a pozzetto dove inserire l'analita e ad una certa distanza una finestra dove, in sottili linee trasversali sono depositati i reagenti rivelatori, in genere gli anticorpi specifici nella linea di test e anticorpi non specifici nella linea di controllo. una provetta contenente una soluzione che ha lo scopo di esporre gli antigeni, proteine del virus, agli anticorpi rivelatori (soluzione di estrazione) o una soluzione tampone in cui diluire il muco contenente i virioni. La soluzione di estrazione è tipicamente composta da tensioattivi non ionici, ad esempio polietossilati, potenti biocidi, ad esempio isotiazolinoni che non interagiscono con gli anticorpi. La soluzione d'estrazione ha inoltre la funzione di inattivare il virus. La soluzione tampone contiene tipicamente oltre al tampone fosfato salino piccole concentrazioni di sodio azide e non compromette la superficie del virione.
La prima fase della procedura del test prevede il prelievo del muco dalle mucose nasali o orofaringee, sono disponibili anche RAT che prevedono il prelievo della saliva ma danno risultati meno precisi.
La seconda fase richiede la miscelazione del muco nella soluzione di estrazione, dove il tensioattivo e il biocida disattivano il virus e compromettono i leganti lipidici del capside liberando le proteine di superficie o nella soluzione tampone dove si disperdono i virioni.
Nella terza fase l'analita, cioè il prelievo diluito nelle soluzioni, viene inserito nel pozzetto impregnando e idratando l'area sottostante della striscia di nitrocellulosa; diffondendosi dove sono depositati gli anticorpi marcati, cioè coniugati con un cromoforo o un composto cromogenico. Gli anticorpi marcati nell'area sotto il pozzetto sono specifici per l'antigene bersaglio. In molti RAT sono presenti anche anticorpi non specifici o streptavidina marcati a volte con un cromoforo diverso da quello che marca gli anticorpi specifici. Se l'antigene SARS-CoV-2 è presente, si legherà al coniugato anticorpo specifico/composto cromogenico formando un immunocomplesso che per flusso capillare si espande lateralmente lungo la striscia fino a raggiungere una sottile linea trasversale di reazione, la linea di test. Questa è formata depositando e impregnando la striscia con l'anticorpo monoclonale, anch'esso specifico per l'antigene bersaglio, e in certi casi un reagente cromogenico. Se è presente l'antigene si forma il complesso sandwich a doppio anticorpo con l'antigene legato da una parte all'anticorpo marcato, dall'altra all'anticorpo della linea di test. Il composto cromoforo o cromogenico, che cambia il colore alle linee di test e di controllo, varia da modello a modello di RAT anti Covid-19. Spesso si tratta di una dispersione di nanoparticelle metalliche, tipicamente oro colloidale, che per effetto Tyndall aggregandosi sulla linea di reazione modificano il colore percepito del reagente. Ma sono in commercio anche RAT per il COVID-19 che utilizzano nanoparticelle di europio, particelle di lattice o polistirene caricate con pigmenti o cromogeni. In certi casi gli anticorpi marcati sono legati alla biotina, in modo da produrre un colore visibile nella linea di test o di controllo a contatto con la streptavidina. Il sensore cromatografico utilizzato nei diversi test può operare nella gamma del visibile (colore percepito) o per fluorescenza. In quest'ultimo caso la lettura del risultato del test richiede specifiche apparecchiature.
Nella quarta fase, proseguendo la diffusione laterale lungo la striscia di nitrocellulosa, gli anticorpi marcati raggiungono, a circa un 1 cm di distanza dalla linea di test, una ulteriore linea trasversale di reazioneː la linea di controllo. Questa è formata impregnando/depositando anticorpi policlonali, come l'IgG anti-topo da capra o IgG anti-pollo da capra o anti-coniglio, in grado di complessare gli anticorpi marcati dal cromoforo o cromogeno anche in assenza dell'antigene. Alcuni RAT rivelano nelle linea di controllo un colore diverso da quello della linea di test. Per la reazione cromatografica sulla linea di controllo alcuni RAT in commercio sfruttano l'affinità biotina-streptavidina.
Se si colorano entrambe le linee di reazione l'esito del test è positivo.
Se si colora solo la linea di controllo l'esito del test negativo.
Se la linea di controllo non si colora, il test non è valido.
Storia dello sviluppo della tecnologia dei test rapidi COVID-19
I test rapidi per la COVID-19 sono emersi dai grandi investimenti del controverso programma Moonshot del Regno Unito, un programma da 100 miliardi di sterline per valutare sistematicamente, sviluppare e implementare nuove tecnologie per i test COVID-19. I test rapidi inizialmente si trovavano all'interno di questa pipeline di valutazione sistematica insieme a molte altre tecnologie di test COVID-19 putative come Lamp, Lampore, PCR point of care, spettrometria di massa e pooling di campioni. Tuttavia, con il proseguire delle valutazioni, i test rapidi sono emersi come la forma di test COVID-19 di maggior successo all'interno di questo programma per integrare i test PCR esistenti.
Guida internazionale per l'uso e lo sviluppo della tecnologia dei test rapidi COVID-19
Il razionale scientifico iniziale per la potenziale utilità dei test rapidi e la direzione globale per lo sviluppo della tecnologia dei test rapidi sono stati rafforzati da una guida provvisoria dell'OMS che ha segnalato i potenziali benefici. Il rapporto notava che i test rapidi erano molto più facili da implementare e avevano vantaggi in termini di costi. L'OMS ne raccomandava l'uso nei focolai, per l'identificazione precoce dei casi e per monitorare le tendenze della malattia. Più tardi, e in seguito a un corpo di studi in rapido aumento, questa raccomandazione fu ampliata dalla Commissione europea. La Commissione europea ha raccomandato l'uso della tecnologia dei test rapidi per lo screening a livello di popolazione quando la percentuale di positività al test è alta o molto alta. Nel gennaio 2021, la Commissione europea ha accettato di rafforzare la sua posizione, sostenendo un uso molto più ampio dei test rapidi, notando che "se la ricerca dimostrasse che i test rapidi per l'antigene possono essere condotti dal tester stesso.... l'auto-test con o senza guida professionale potrebbe anche essere considerato."
Test molecolare e falsi negativi L'esame più praticato per la diagnosi di infezione da coronavirus è il tampone naso-faringeo (basato sulla tecnica RT-PCR: Reverse-transcriptase polymerase chain reaction). Ovviamente la RT-PCR può essere praticata anche su altro materiale biologico, per esempio saliva, feci, liquido di lavaggio bronvoalveolare, sangue.
Per limitarci al tampone naso-faringeo va considerato che la sua performance può essere gravata da una percentuale di falsi negativi. In effetti si stanno moltiplicando le segnalazioni di pazienti che pur avendo sintomi caratteristici di COVID-19 (polmonite interstiziale dimostrata alla TC, dispnea, insufficienza respiratoria, etc.) presentano un tampone negativo anche in due occasioni.In qualche caso, in cui il paziente è stato sottoposto a intubazione, il virus si è evidenziato nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL).Non si tratta di una novità. In precedenti occasioni questa testata ha recensito studi che sottolineavano come il tampone naso-faringeo possa avere una sensibilità non ottimale. Questo può dipendere da vari fattori, non ultimi la non corretta tecnica di esecuzione del test e il timing cioè il momento in cui l'esame viene effettuato. Uno studio ha valutato la sua sensibilità in relazione al momento in cui un paziente viene infettato .Secondo questo studio la probabilità di un falso negativo è praticamente del 100% se il tampone viene effettuato il giorno stesso in cui il paziente si infetta, mentre è del 67% dopo 3 giorni. Se il tampone viene effettuato il 4 giorno dall'infezione, la percentuale di falsi negativi scende al 20%, dopo 5 giorni scende ancora al 3%.
Studi iniziali