Si laureò all'Università Johns Hopkins nel 1927, dove trascorse altri due anni al Dipartimento di Fisica, prendendo corsi e lavorando come studente nel laboratorio di A.H. Pfund. Andò quindi a studiare per un semestre all'Università di Lipsia, e per due a quella di Monaco.
Nel 1931, tornato negli Stati Uniti, prese parte al Johnson Research Foundation of Medical Physics all'Università della Pennsylvania. Nel 1949 tornò all'Università Johns Hopkins e divenne professore di biofisica. Hartline iniziò a far parte dello staff della Rockfeller University nel 1953, restandovi fino al 1974.
Hartline investigò l'attività elettrica della retina nei vertebrati, negli artropodi e nei molluschi, perché il loro sistema visivo è più semplice rispetto a quello umano e facilita quindi una modellizzazione semplificata dei processi visivi. Inoltre studiò l'attività elettrica dell'occhio e del nervo ottico a livello cellulare.
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