Il microscopio (dal greco: mikrón "piccolo" e σκοπέω "guardare") è uno strumento ottico che consente di ingrandire o produrre immagini di oggetti piccoli altrimenti impossibili da studiare a occhio nudo. Permette di osservarne i dettagli mediante una osservazione diretta ad occhio nudo, oppure indiretta tramite la fotografia e/o sistemi elettronici. Il microscopio può essere di tipo ottico, basato sull'osservazione diretta dello spettro elettromagnetico visibile, oppure elettronico, basato sull'osservazione tramite fasci di elettroni, o a scansione di sonda, basato sull'esplorazione della superficie del campione con una sonda materiale, oppure di altro tipo.
I primi strumenti utilizzabili, nell'ambito dei microscopi di tipo ottico, vennero prodotti nei Paesi Bassi alla fine del XVI secolo, ma autore e datazione dell'invenzione vera e propria sono tuttora oggetto di controversia. Galileo ne inviò uno di sua costruzione al principe Federico Cesi, fondatore dell'Accademia dei Lincei, per mostrargliene il funzionamento. Galileo definiva lo strumento un "occhialino per vedere le cose minime"G. Galilei, Lettera a Federico Cesi, Firenze, 23 settembre 1624, in G. Galilei, Opere, ed. nazionale a cura di A. Favaro, Firenze 1968, vol. XIII, pp. 208-209.. Tra i primi scienziati ad utilizzare, diffondere e migliorare l'uso di questo potente strumento, a partire dal XVII secolo, si ricordano Marcello Malpighi, Antoni van Leeuwenhoek, Robert Hooke e Bartolomeo Panizza. Quest'ultimo ebbe il merito di istituire il primo corso di anatomia microscopica in Italia.
Storia
Descrizione Costituenti Il microscopio è formato da una parte meccanica, strutturale e una parte tradizionalmente chiamata ottica, funzionale.
Parte meccanica La parte meccanica deve essere robusta e relativamente pesante per consentire la necessaria stabilità al sistema. Lo stativo rappresenta il corpo principale del microscopio ed ha la funzione di fare da supporto ai meccanismi di movimento e di messa a fuoco dalla parte ottica.
La parte meccanica del microscopio alloggia anche il sistema di illuminazione, in caso di sistemi con illuminazione incorporata. Il preparato da osservare si pone sul tavolino portaoggetti, dotato di un carrello traslatore per mezzo del quale il preparato può essere spostato agevolmente eventualmente con movimenti meccanici micrometrici nelle direzioni destra-sinistra e avanti-indietro. Al di là del tavolino portaoggetti, verso l'illuminazione si trova un supporto meccanico che ospita il condensatore ed il diaframma di apertura. Ancora oltre, prima dell'illuminatore, si trova il diaframma di campo. Il microscopio deve essere dotato di un sistema molto accurato di messa a fuoco sia del preparato che del sistema di illuminazione. Il tavolino portaoggetti viene spostato verticalmente rispetto all'obiettivo attraverso i comandi di messa a fuoco macrometrici e micrometrici (o alternativamente si può spostare l'ottica rispetto al tavolino). Il condensatore focalizza correttamente l'illuminazione sul preparato, il collettore focalizza la sorgente luminosa in un particolare piano ottico del condensatore.
Parte funzionale La parte funzionale, in genere chiamata ottica per gli strumenti basati sull'utilizzo della luce, è formata da tre o quattro sistemi di lenti e dalla sorgente, che, nei sistemi composti a radiazione trasmessa, partendo dalla base del microscopio, sono: la sorgente; il collettore della sorgente o condensatore di campo, col diaframma di campo; il condensatore con il diaframma di apertura; l'obiettivo; l'oculare.
L'eventuale parte di microscopio, nella quale vanno inseriti gli obiettivi multipli, che possono essere scelti in base all'ingrandimento voluto, si chiama revolver.
Potere di risoluzione
Nel caso che lo strumento si basi sull'utilizzo di radiazione con una propria lunghezza d'onda associata, come i tradizionali microscopi ottici, risoluzione e lunghezza d'onda utilizzata sono parametri tra loro strettamente correlati. Mentre, i microscopi che si basino su diverse tecnologie, come ad esempio l'AFM, ovviamente rispondono a considerazioni differenti.
La risoluzione laterale di un microscopio ottico è quella minima distanza tra due punti, che permette ancora di distinguerli; se la distanza tra i due punti è minore, essi si confondono in uno solo. In prima approssimazione, e non tenendo conto di aberrazioni ottiche, possiamo considerare che la relazione che lega la risoluzione laterale (d, ovvero la distanza tra due punti tra loro risolti), la lunghezza d'onda della radiazione utilizzata e l'apertura numerica di un sistema ottico (tutto il sistema) sia:
Questa relazione è generalmente nota come principio di Abbe.
Per un microscopio ottico in luce visibile, d raggiunge i 0,2 μm; il microscopio elettronico arriva a 0,1 nm (è ~ 2000 volte più risolvente).
Il potere risolutivo è il reciproco della risoluzione laterale.
Ingrandimento Si definisce tale, il rapporto tra le dimensioni dell'immagine ottenuta e quelle dell'oggetto originale.
L'ingrandimento lineare o angolare (da non confondersi con quello areale o di superficie, alle volte utilizzato), in caso di microscopi composti è dato da:
dove è l'ingrandimento dell'obiettivo, dipendente dalla sua lunghezza focale e dalla distanza tra il piano focale posteriore dell'obiettivo e il piano focale dell'oculare, ed quello dell'oculare.
viene chiamato anche lunghezza ottica del tubo, fissa, e nei moderni strumenti ottici generalmente di 160 mm. Da notare che gli obiettivi devono essere progettati per una data lunghezza ottica di utilizzo (riportata sull'obiettivo stesso). In passato era abbastanza diffusa la misura 170 mm, mentre attualmente ha preso piede la progettazione di sistemi corretti all'infinito. Anche l'ingrandimento oculare dipende dalla sua lunghezza focale e può essere calcolato dalle normali equazioni delle lenti di ingrandimento.
Quindi, per calcolare l'ingrandimento al quale si osserva un campione, si moltiplica quello proprio dell'obiettivo per quello dell'oculare. Tale ingrandimento è quello dell'immagine visibile, idealmente riportata sul piano in cui giace il campione stesso, e cioè alla distanza tra quest'ultimo e l'occhio dell'osservatore. Diversa è la situazione se l'immagine viene raccolta su uno schermo o una lastra fotografica: in questo caso è necessario tenere conto dell'altezza dello schermo (o pellicola) rispetto all'oculare e l'ingrandimento sarà quello risultante sul negativo. In questi casi conviene sempre usare un vetrino micrometrico, per avere un sicuro termine di paragone. Con i migliori obiettivi ed oculari e nelle ideali condizioni di illuminazione l'ingrandimento utile, senza perdita di risoluzione, del microscopio ottico può raggiungere i 1000 - 1500 diametri (1000 - 1500×).
Aumentando il tiraggio del tubo o proiettando l'immagine su uno schermo lontano, si potrebbero raggiungere ingrandimenti molto maggiori, ma il potere risolutivo che, come abbiamo visto sopra, è funzione della lunghezza d'onda della luce visibile, non ne sarebbe in alcun modo incrementato.
Aberrazioni Le principali aberrazioni, difetti del sistema nel formare un'immagine nitida e risolta, che affliggono i microscopi, e le loro eventuali correzioni si possono riassumere in: Aberrazione sferica: sistemi asferici Aberrazione cromatica: sistemi acromatici e apocromatici Astigmatismo dei fasci obliqui: sistemi anastigmatici Coma: sistemi asferici Curvatura di campo distorsione a cuscino e barilotto: sistemi asferici A seconda della branca di microscopia considerata, tali difetti saranno più o meno rappresentati. Ad esempio utilizzando radiazione di una sola lunghezza d'onda, non avremo aberrazioni di tipo cromatico.
Tipologie I microscopi si dividono sommariamente, a seconda del sistema adoperato per indagare il campione, in microscopi ottici, elettronici, a scansione di sonda e di altro tipo:
Il microscopio ottico utilizza come sorgente la luce, intesa in senso generale come radiazione elettromagnetica dal vicino infrarosso all'ultravioletto, anche se i microscopi più diffusi utilizzano proprio la radiazione visibile, ha risoluzione tipicamente minore rispetto al microscopio elettronico, ma è generalmente economico e fornisce immagini a colori anche di organismi viventi. Con il microscopio ottico si possono ad esempio distinguere i batteri. Una descrizione a sé merita tuttavia lo SNOM (Scanning Near-Field Optical Microscope), descritto in seguito, che permette di raggiungere risoluzioni fino a 200 nm. In pratica migliora la visione a occhio nudo di 500 volte. Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) utilizza come sorgente un fascio doppio di elettroni di un certo potenziale, ha risoluzione maggiore di quello ottico e permette di rilevare, oltre all'immagine, anche numerose altre proprietà fisiche del campione, ma è molto complesso e costoso, deve funzionare in assenza d'aria, inoltre non fornisce immagini in vivo. Le immagini, ottenute al di fuori del campo del visibile, possono essere in bianco e nero o a falsi colori. Permette con i maggiori ingrandimenti di distinguere gli atomi. È quasi mille volte più potente del microscopio ottico ed ha una risoluzione che si spinge, in casi estremi, fino a 0,05 nanometri. Il microscopio a scansione di sonda (SPM) esplora il preparato in maniera analoga a quello che fa una puntina grammofonica, basandosi su diversi fenomeni fisici di scala molecolare e atomica come l'effetto tunnel e le forze di Van der Waals. Ha una risoluzione limitata, di 10 nm, ma permette rappresentazioni tridimensionali di cellule e di strutture cellulari. Altri tipi di microscopi sfruttano diverse radiazioni, le onde acustiche e differenti fenomeni fisici.
Data la vastità dell'argomento, quella che segue è solamente una sintesi. Per l'approfondimento si rimanda alle specifiche singole voci.
Microscopio ottico
I microscopi ottici, che utilizzano le lunghezze d'onda della luce visibile, sono i più semplici e quelli di più comune utilizzo. Sono costituiti da un sistema di lenti adatto a focalizzare la luce nell'occhio o in un altro dispositivo rivelatore. L'ingrandimento tipico dei microscopi ottici, all'interno dello spettro di luce visibile, è fino a 1500x, con un limite di risoluzione teorica di circa 0,2 µm. Tecniche più sofisticate, come la microscopia confocale a raggio laser o la vertico SMI, possono superare questo limite di ingrandimento, ma la risoluzione è limitata dalla diffrazione. L'utilizzo di lunghezze d'onda più piccole, come l'ultravioletto, è un modo per migliorare la risoluzione spaziale del microscopio ottico, così come la microscopia ottica in campo prossimo (SNOM).
Microscopio a raggi X
Tale microscopio è basato sull'utilizzo di radiazioni X molli, come radiazioni sincrotroniche. A differenza della luce visibile, i raggi-X non si riflettono né si rifrangono facilmente, e sono invisibili per l'occhio umano, ponendo diversi problemi tecnologici. La risoluzione è intermedia tra il microscopio ottico ed elettronico, ma con diversi vantaggi nell'osservazione delle strutture biologiche.
Viene utilizzato anche per studiare le strutture di molecole e ioni presenti all'interno della cellula mediante analisi delle figure di diffrazione analogamente alla cristallografia a raggi X. Quando i raggi emessi attraversano le strutture cellulari subiscono delle diffrazioni che verranno impresse su una lastra fotografica, apparendo come delle sfocate bande concentriche. Dalla analisi della differente disposizione di tali bande si potrà determinare la distribuzione atomica delle molecole all'interno dei tessuti analizzati.
Microscopi elettronici e ionici
Il microscopio elettronico "illumina" i campioni in esame, invece che con un fascio di luce visibile, con un fascio di elettroni, di lunghezza d'onda quindi più breve, e per il principio di Abbe permette di ottenere immagini con una risoluzione maggiore.