Il ciclo di Krebs (anche detto ciclo degli acidi tricarbossilici, ciclo dell'acido citrico e ciclo dell'ossalacetato) è un ciclo metabolico di importanza fondamentale in tutte le cellule che utilizzano ossigeno nel processo della respirazione cellulare.
In questi organismi aerobi il ciclo di Krebs è la via metabolica in cui confluiscono le vie del catabolismo dei carboidrati, dei grassi e delle proteine, portando alla produzione di energia chimica principalmente tramite la sintesi di elementi fondamentali per la catena respiratoria. Si tratta di una via anfibolica poiché partecipa anche a processi anabolici., fornendo alcuni precursori di amminoacidi (ad esempio l'α-chetoglutarato e l'ossalacetato) e di altre molecole fondamentali per la cellula.
Molti dei componenti e delle reazioni che compongono il ciclo dell'acido citrico furono determinati nel 1930 grazie alla ricerca di Albert Szent-Györgyi, che nel 1937 ricevette il premio Nobel per le sue scoperte su un componente chiave del ciclo, l'acido fumarico. Il ciclo nella sua interezza fu poi identificato nel 1937 dal biochimico anglo-tedesco Hans Adolf Krebs, che per questa scoperta fu insignito del premio Nobel per la medicina nel 1953..
Storia
Descrizione Il ciclo di Krebs avviene nei mitocondri delle cellule eucariote e nel citoplasma delle cellule procariote..
I catabolismi glucidico e lipidico (attraverso la glicolisi e la beta ossidazione) producono acetil-CoA, un gruppo acetile legato al coenzima A; l'acetil-CoA costituisce il principale substrato del ciclo: il suo ingresso consiste in una condensazione con ossalacetato per generare citrato e al termine del ciclo stesso, i due atomi di carbonio immessi dall'acetil-CoA verranno ossidati in due molecole di anidride carbonica, rigenerando nuovamente ossalacetato in grado di condensarsi con acetil-CoA. La produzione rilevante dal punto di vista energetico, tuttavia, è quella di una molecola di GTP (immediatamente utilizzata per rigenerare una molecola di ATP), di tre molecole di NADH e una di FADH2.
I coenzimi ridotti (NADH e FADH2) si comportano come intermedi ossidoriduttivi. Quando ridotti, essi sono in grado di trasportare elettroni a energia relativamente alta (sottratti ai substrati ossidati ad esempio nella glicolisi o nello stesso ciclo di Krebs) fino alla catena respiratoria mitocondriale, dove vengono riossidati (a NAD+ e FAD) e cedono gli elettroni alla catena stessa, che sarà così in grado di rigenerare molecole di ATP da ADP.
La reazione netta è la seguente:.
L'energia che si ricava dalla completa demolizione di una molecola di glucosio attraverso i quattro diversi stadi della respirazione cellulare (glicolisi, piruvato deidrogenasi, ciclo di Krebs e catena di trasporto di elettroni), è di 30-32 molecole di ATP a seconda del meccanismo seguito per trasferire il potere riducente del NADH citosolico alla matrice cellulare: 30 ATP con lo shuttle del glicerolofosfato, 32 ATP con lo shuttle del malato aspartato.
Substrato Coenzimi Enzima Tipo di reazione Inibitori Attivatori Prodotto 1 Ossalacetato Acetil-CoA, acqua Citrato sintasi Condensazione Citrato, NADH, Succinil-CoA — Citrato 2a Citrato — Aconitasi Deidratazione — — cis-aconitato, acqua 2b cis-Aconitato Acqua Idratazione Isocitrato 3a Isocitrato NAD+ Isocitrato deidrogenasi Ossidazione NADH, ATP Ca2+, ADP Ossalsuccinato, NADH 3b Ossalsuccinato H+ Decarbossilazione α-chetoglutarato, CO2 4 α-Chetoglutarato NAD+, CoA-SH α-chetoglutarato deidrogenasi Decarbossilazione ossidativa NADH, Succinil-CoA Ca2+ Succinil-CoA, NADH, CO2 5 Succinil-CoA GDP, Fosfato Succinil-CoA sintetasi Trasferimento di fosfato — — Succinato, GTP, CoA-SH 6 Succinato FAD Succinato deidrogenasi Ossidazione — — Fumarato, FADH2 7 Fumarato Acqua Fumarasi Idratazione — — L-malato 8 L-Malato NAD+ Malato deidrogenasi Ossidazione — — Ossalacetato, NADH
Tappe del ciclo di Krebs Reazione 1: citrato sintasi
La citrato sintasi catalizza la condensazione dell'ossalacetato con acetil-CoA, a ottenere citrato. La sua struttura quaternaria consta di due subunità, a ognuna delle quali si possono legare i due substrati.
Il sito attivo dell'enzima attiva l'acetil-CoA per renderlo affine a un centro carbonioso dell'ossalacetato: in seguito al legame tra le due molecole, il gruppo tioestere (CoA) viene idrolizzato, formando così la molecola di citrato..
La reazione è altamente esoergonica (), motivo per cui questo passaggio, in condizioni standard, è irreversibile. Il citrato prodotto dall'enzima, inoltre, è in grado di inibire competitivamente l'attività dell'enzima: pur essendo la reazione molto favorita (perché esoergonica) la citrato sintasi può essere saldamente regolata. Questo aspetto ha una notevole importanza biologica dal momento che permette una completa regolazione dell'intero ciclo di Krebs, rendendo l'enzima una sorta di "pacemaker" dell'intero ciclo.
Reazione 2: aconitasi
L'aconitasi catalizza la isomerizzazione del citrato a isocitrato (attraverso la formazione di cis-aconitato).. L'enzima catalizza anche la reazione inversa, ma nel ciclo di Krebs tale reazione è unidirezionale per la legge di azione di massa: le concentrazioni (in condizioni standard) di citrato (91%), dell'intermedio cis-aconitato (3%) e di isocitrato (6%) spingono la reazione decisamente verso la produzione di isocitrato. Una volta prodotto il cis-aconitato viene addizionata una molecola d'acqua per ossidare il doppio legame a gruppo ossidrilico e con l'addizione di acqua si ottiene l'isocitrato.
Nel sito attivo dell'enzima è presente un cluster ferro-zolfo che, insieme ad alcuni residui amminoacidici polari, lega il substrato.. Più nel dettaglio, il legame al substrato viene assicurato dalla presenza di un residuo di serina, di arginina, di istidina e di aspartato, che permettono il legame stereospecifico del solo citrato 1R,2S, respingendone la forma opposta.
Reazione 3: isocitrato deidrogenasi
La isocitrato deidrogenasi mitocondriale è un enzima dipendente dalla presenza di NAD+ e di Mn2+ e/o Mg2+: inizialmente, l'enzima catalizza l'ossidazione dell'isocitrato a ossalsuccinato, che genera una molecola di NADH a partire da NAD+; successivamente, la presenza di uno ione bivalente che complessa gli ossigeni del gruppo carbossile in posizione alfa aumenta l'elettronegatività di quella regione di molecola, ciò genera un riarrangiamento degli elettroni della molecola con conseguente rottura del legame tra il carbonio in posizione gamma e l'adiacente gruppo carbossile, in questo modo si ha dunque una decarbossilazione (ossia l'uscita di una molecola di CO2)., che porta alla formazione di α-chetoglutarato, caratterizzato da due carbossili alle estremità e da un chetone in posizione alfa rispetto a uno dei due gruppi carbossilici.. Tale reazione, in quanto sufficientemente esoergonica (ΔG°′ = −8,4 kJ/mol), è in grado di spostare in avanti la precedente reazione dalla aconitasi.
Reazione 4: α-chetoglutarato deidrogenasi
La conversione dell'isocitrato in α-chetoglutarato è seguita da una seconda reazione di decarbossilazione ossidativa, che porta alla formazione di succinil-CoA: la decarbossilazione ossidativa dell'α-chetoglutarato è molto simile a quella del piruvato, un altro α-chetoacido.. Entrambe le reazioni includono la decarbossilazione di un α-chetoacido e la conseguente produzione di un legame tioestere ad alta energia con il coenzima A: i complessi che catalizzano tali reazioni sono simili tra loro..
La α-chetoglutarato deidrogenasi (più correttamente detta ossoglutarato deidrogenasi) è infatti composta di tre enzimi differenti. La subunità E1, detta 2-chetoglutarato deidrogenasi, e la E2, detta transsuccinilasi, presentano un'estrema omologia con quelle della piruvato deidrogenasi. La subunità E3, la diidrolipoamide deidrogenasi, invece, è lo stesso polipeptide presente nell'altro complesso enzimatico.
Il differenziale dell'energia libera di questa reazione è ΔG°′ = −30,1 kJ/mol, dunque altamente esoergonica.
Reazione 5: succinil-CoA sintetasi
Il succinil-CoA è un tioestere ad alta energia (la sua ΔG°′ di idrolisi è di circa −33,5 kJ/mol, simile a quella dell'ATP, di −30,5 kJ/mol.). La citrato sintasi si serve di un intermedio avente tale legame ad alta energia per portare a termine la fusione tra una molecola a due atomi di carbonio (acetil-CoA) e una a quattro (ossalacetato). L'enzima succinil-CoA sintetasi si serve invece di tale energia per fosforilare un nucleoside difosfato purinico come il GDP..
L'energia proveniente dal tioestere viene semplicemente convertita in energia legata a un legame fosfato: il primo passaggio della reazione genera un nuovo intermedio ad alta energia, noto come succinil fosfato e successivamente, una istidina presente nel sito catalitico rimuove il fosfato dalla molecola glucidica, generando il prodotto succinato e una molecola di fosfoistidina, che dona velocemente il fosfato a un nucleoside difosfato, "ricaricandolo" a trifosfato. Si tratta dell'unico passaggio del ciclo in cui si ha una fosforilazione a livello del substrato.
Il GTP è principalmente coinvolto nei pathway di trasduzione del segnale: il suo ruolo in un processo energetico come il ciclo di Krebs è invece essenzialmente quello di tramite per il trasferimento di gruppi fosfato verso l'ATP, in una reazione catalizzata dalla nucleoside difosfochinasi..
Reazione 6: succinato deidrogenasi
La parte finale del ciclo vede il riarrangiamento di molecole a quattro atomi di carbonio fino alla rigenerazione dell'ossalacetato; perché ciò sia possibile, il ponte metilene presente sul succinato deve essere convertito in un carbonile, come avviene in altri pathways (ad esempio la beta ossidazione degli acidi grassi), tale conversione avviene attraverso tre passaggi: una prima ossidazione, una idratazione e una seconda ossidazione. Questi tre passaggi, oltre a rigenerare ossalacetato, permettono lestrazione di ulteriore energia attraverso la formazione di FADH2 e NADH..
La prima reazione di ossidazione è catalizzata dal complesso della succinato deidrogenasi, l'unico enzima del ciclo ad avere come accettore di idrogeno il FAD anziché il NAD+: il FAD è legato in modo covalente all'enzima, attraverso un residuo di istidina. L'enzima si serve del FAD poiché l'energia associata alla reazione non è sufficiente per ridurre NAD+.
Il complesso enzimatico è anche l'unico del ciclo a essere annidato all'interno della membrana mitocondriale. Tale posizione è dovuta anche al coinvolgimento dell'enzima nella catena di trasporto degli elettroni (dove è definito "complesso II"): gli elettroni passati sul FAD vengono dunque immessi direttamente nella catena, grazie al legame stabile tra l'enzima e il cofattore stesso..
Reazione 7: fumarasi
La fumarasi catalizza l'aggiunta di un protone e di un gruppo OH− provenienti da una molecola d'acqua alla molecola in posizione trans. Dal momento che l'enzima è in grado di legare OH- solo da un lato, il fumarato può essere convertito solo in L-malato.
Vi sono due classi di fumarasi: la classe I e la classe II. La classificazione dipende dalla disposizione delle loro subunità relative, dalla necessità di metallo e dalla loro stabilità termica. Le fumarasi di classe I sono in grado di modificare lo stato o diventare inattive se sottoposte a calore o radiazioni, sono sensibili all'anione superossido, sono dipendenti dal ferro II (Fe2+) e sono proteine dimeriche, comprensive di circa 120 kD. Le fumarasi di classe II si trovano nei procarioti e negli eucarioti; sono enzimi tetramerici di 200 000 D che contengono tre distinti segmenti di amminoacidi significativamente omologhi e sono anche indipendenti dal ferro e termo-stabili. I procarioti sono noti per avere tre diverse forme di fumarasi: fumarasi A, fumarasi B e fumarasi C, quest'ultima fa parte delle fumarasi di classe II, mentre le fumarasi A e le fumarasi B sono classificate come di classe I.
Reazione 8: malato deidrogenasi