Il franchise di Mario presenta numerosi personaggi che vivono nel Regno dei Funghi o in altre località come l'Isola Delfina. Il ruolo di questi personaggi può variare a seconda dei titoli in cui compaiono, secondo uno stile che Shigeru Miyamoto ha attinto da fumettisti quali Osamu Tezuka e Fujio Akatsuka, nonché da Elzie Crisler Segar:
I personaggi di Mario compaiono infatti, oltre che nei classici platform dove l'eroe baffuto deve salvare la principessa, anche in titoli di genere rompicapo, sportivo (in particolare simulatori di guida), di ruolo o educativo.
Personaggi principali Mario
È un baffuto idraulico italoamericano vestito di rosso, protagonista del franchise. Nella maggior parte dei titoli principali del franchise cerca di salvare la principessa Peach, la quale viene rapita quasi sempre da Bowser.
Luigi
È il fratello gemello minore di Mario. Anche lui è un baffuto idraulico italoamericano, ma a differenza del fratello maggiore, è vestito di verde, è più magro ed è più alto, oltre che più impacciato e fifone.
Principessa Peach
È la principessa e sovrana del Regno dei Funghi. Spesso viene rapita da Bowser e salvata da Mario.
Bowser
È il re dei Koopa e antagonista principale della serie. Minaccia costantemente il Regno dei Funghi, rapendo spesso la principessa Peach. A Mario spetta il compito di sconfiggerlo e salvare la principessa in pericolo.
Toad
È una specie senziente di funghi umanoidi che vive nel Regno dei Funghi, alcuni di questi hanno ruoli importanti: Mastro Toad, maggiordomo e padrino della principessa Peach. Capitan Toad, capo della squadra di esplorazione Toad, che non sa saltare a causa del suo grosso zaino. Toadette, una ragazza con trecce rosa.
Yoshi
Compagno fedele, alleato e padrino di Mario, è un dinosauro proveniente dall'Isola Yoshi. È in grado di fluttuare in aria e di mangiare i nemici con la sua lingua, ne esistono di più colori, il più famoso è verde chiaro.
Donkey Kong
È il nipote del primo avversario di Mario, Donkey Kong Sr. alias Cranky Kong. È il protagonista della serie Donkey Kong Country e amico-nemico di Mario, in diverse occasioni.
Alleati ricorrenti Pauline
È la "damigella in pericolo" rapita da Donkey Kong e salvata da Mario nel videogioco Donkey Kong. Rimane un personaggio ricorrente nei giochi della serie Mario vs. Donkey Kong e appare come sindaco in Super Mario Odyssey.
Principessa Daisy
È la principessa di Sarasaland, luogo apparso in Super Mario Land per Game Boy. Si distingue da Peach per un modo di fare meno femminile e più vicino a quello di un maschio.
Diddy Kong
È amico e compagno di avventure di Donkey Kong nella serie Donkey Kong Country.
Funky Kong
Personaggio della serie Donkey Kong Country, è descritto come amico e collaboratore di Donkey Kong nelle sue avventure.
Professor Strambic Il Professor Strambic (Doctor Oya Mā in giapponese, in omaggio al game designer Yoshiyuki Oyama; Professor Elvin Gadd nella versione statunitense) è uno scienziato e inventore di straordinario ingegno che ha più volte aiutato Luigi a salvare i suoi amici. È un ometto di bassa statura, con un enorme ciuffo bianco sulla testa, degli occhiali con lenti enormi e un camice bianco. Nei giochi il suo modo di parlare consiste in buffi versi o raramente in parole vere. Appare per la prima volta in Luigi's Mansion, dove salvò Luigi con la sua geniale invenzione, il Poltergust 3000, una sorta di aspirapolvere in grado di aspirare i fantasmi, e aiuta Luigi a ritrovare suo fratello Mario, imprigionato dal malvagio Re Boo. In Super Mario Sunshine il professore viene solo citato e lo Splac 3000, congegno capace di spruzzare getti d'acqua, è una sua invenzione, così come il magico pennello che possiede Mario Ombra. In Mario & Luigi: Superstar Saga il professore ha aperto un Caffè nel cuore della città di Fagiolandia, dove si recherà di persona ad assaggiare il suo caffè di fagioli, e regalare a Mario e Luigi un congegno speciale. In Mario & Luigi: Fratelli nel tempo i due fratelli Mario viaggiano nel tempo grazie alla macchina del tempo del professore. È sua anche la valigia "Valigi8.0", assistente dei protagonisti nel gioco.
Mastro Toad Mastro Toad (Toadsworth in inglese e in giapponese) è un fedele servitore della Principessa Peach, è un fungo antropomorfo anziano che segue la sua protetta fin da quando questa era bambina, preoccupandosi molto per la sua salute. In Mario Kart: Double Dash!! ha un fortissimo go-kart personale che viene usato dai vincitori del trofeo nella premiazione (può essere sbloccato). In Mario Party 7 invita Mario e i suoi amici in una splendida crociera, ma Bowser, che non era stato invitato, cercherà di rovinargli la vacanza. In Mario & Luigi: Superstar Saga regalerà ai due fratelli una valigia che sarà utile per tutta l'avventura. In Mario & Luigi: Fratelli nel tempo insieme a sé stesso da giovane insegna delle nuove mosse ai due fratelli. In Mario & Luigi: Viaggio al centro di Bowser viene risucchiato all'interno di Bowser insieme ad altri Toad. Compare brevemente per assistere Mario e Luigi all'interno di una parte del corpo di Bowser. Mentre i due fratelli si addentrano all'interno di un nervo, lui e Toadoberto aspettano sorseggiando del tè. Appare inoltre in Super Mario Sunshine dove accompagna Mario e i suoi amici in vacanza sull'Isola Delfina e in New Super Mario Bros. dove viene visto nella "Casa Toad"; qui il suo compito è dare a Mario un oggetto a sorte. È doppiato in inglese da Scott Burns e in italiano da Marco Balzarotti.
Strutzi
È un draghetto rosa di sesso femminile che può sputare uova dalla bocca. Appare inizialmente come nemico di Mario in Super Mario Bros. 2 per NES.
Toadette
è un Toad femmina, a differenza di quest'ultimo è vestita di rosa, ha una coppia di treccine rosa e dei pallini bianchi sulla testa. È la sorella di Toad; il suo nome giapponese è una combinazione di "Kinopio" e "-ko", un comune suffisso di nome femminile giapponese. Toadette apparve per la prima volta in Mario Kart: Double Dash!! come personaggio segreto, in coppia con Toad. La sua caratteristica unica in questo gioco è il potenziamento Fungo scatto dorato che consente al go-kart di utilizzare dei mini turbo continui. In seguito, Toadette è riapparsa in svariati spin-off sportivi della serie di Mario. In New Super Mario Bros. U Deluxe, Toadette, per la prima volta nella serie, diventa giocabile in un gioco platform di Mario, sostituendo il Toad giallo. A differenza degli altri personaggi, tramite l'utilizzo della Super Corona può trasformarsi in Peachette, una sua versione simile a Peach, ma con le caratteristiche fisiche di Toadette. Peachette è in grado di fluttuare in aria e fare un doppio salto. Peachette, inoltre, appare come personaggio giocabile in Mario Kart Tour. È doppiata in inglese da Samantha Kelly.
Rosalinda
È la madre adottiva degli Sfavillotti e vive sull'Osservatorio Cometa, luogo apparso in Super Mario Galaxy per Wii. È diventata, in seguito, un personaggio ricorrente in quasi tutti i giochi usciti dopo esso.
Sfavillotti Gli Sfavillotti sono piccole creature a forma di stella che vivono nello spazio.
Ruboniglio
È una creatura a forma di coniglio che ruba oggetti ai Toad. È stato nel 2012 introdotto come nemico in New Super Mario Bros. U e da New Super Luigi U è diventato un personaggio giocabile.
Mucca
È una mucca che cammina a quattro zampe, introdotta in Mario Kart 64 e usata spesso come ostacolo nei percorsi della serie. Da Mario Kart World è diventata un personaggio giocabile.
Antagonisti Bowser Jr.
È il figlio di Bowser e spesso lo aiuta a realizzare i suoi scopi malvagi. Compare per la prima volta in Super Mario Sunshine, dove Bowser gli racconta (mentendogli) che la Principessa Peach è la sua vera madre e Mario l'ha rapita.
Kamek è un anziano Magikoopa, mentore di Bowser. Indossa un abbigliamento da mago di colore blu e possiede uno scettro. Occasionalmente si muove a cavallo di una scopa. Il suo nome deriva dalla parola giapponese kame (tartaruga).
Kamek appare per la prima volta nel videogioco Super Mario World 2: Yoshi's Island in cui tenta di rapire Baby Mario e Baby Luigi al fine di proteggere Baby Bowser. I suoi piani tuttavia vanno in fumo a causa del provvidenziale intervento di Yoshi.
Nei giochi assume raramente il ruolo di boss e preferisce delegare il compito ad uno dei nemici di Mario, usando la sua magia per ingigantirlo e renderlo più potente. Kamek è presente in Yoshi's Island DS per Nintendo DS ed in alcuni titoli della serie Mario Party (Mario Party 5, Mario Party Advance, Mario Party 9 e in Super Mario Party, in cui riveste il ruolo di giurato. In particolare in Mario Party DS è il boss del tabellone "La Biblioteca di Kamek").
Appare anche nei videogiochi Mario & Luigi: Superstar Saga, Mario & Luigi: Fratelli nel tempo, Mario & Luigi: Viaggio al centro di Bowser e Mario & Luigi: Dream Team Bros.. Oltre a fare una breve comparsa in Super Mario Galaxy, Kamek è uno dei boss finali di New Super Mario Bros. Wii.
In Mario Kart Wii è presente una moto, la Kamekruiser, basata sul personaggio di Kamek, mentre in Mario Kart Tour e in Mario Kart 8 Deluxe è un personaggio giocabile. Kamek fa un cameo anche in Super Smash Bros. per Nintendo 3DS e Wii U mentre modifica con la sua magia lo scenario "Mushrooms Kingdom U" durante la lotta tra i personaggi giocabili e in avventura smash come nemico.
Bowserotti
Sono i fedeli scagnozzi di Bowser. Nella loro prima apparizione in Super Mario Bros. 3 per NES, erano considerati i figli di Bowser. I loro nomi sono: Larry Koopa Morton Koopa Junior Iggy Koopa Roy Koopa Lemmy Koopa Ludwig Von Koopa (o Ludwig Koopa) Wendy O. Koopa
Wario
È il rivale di Mario, apparso come nemico in Super Mario Land 2: 6 Golden Coins per Game Boy. Più corpulento di Mario, è avaro e pensa sempre ad arricchirsi.
Waluigi
È il rivale di Luigi e amico di Wario. Alto, magro e smilzo, appare per la prima volta in Mario Tennis per Nintendo 64.
Pipino Piranha è una Pianta Piranha umanoide, boss ricorrente nella serie; è apparso per la prima volta in Super Mario Sunshine. Pipino è una Pianta Piranha diversa in alcuni tratti: la sua testa è infatti provvista di petali che assomigliano ad una corona e di grosse labbra munite di denti aguzzi; il resto del corpo ha due minuscole zampe a punta, due braccia simili a foglie in grado di far librare in aria il mostro e delle mutande a pois.
In Super Mario Sunshine Il suo attacco consiste nel vomitare una sostanza simile a vernice per danneggiare Mario e per sconfiggerlo bisogna fargli bere tanta acqua e colpirgli l'ombelico. In Super Princess Peach è in grado di sputare tante Pianta Tenaglia, che danneggiano il protagonista saltellando e morsicando. Pipino Piranha viene considerato maschio in America, dove si chiama Petey Piranha, e in Italia. Invece viene considerato femmina in Francia e Giappone. È apparso anche come boss in Mario & Luigi Fratelli nel Tempo, New Super Mario Bros, Super Smash Bros. Brawl e Paper Mario: Sticker Star, mentre è un personaggio giocabile in Mario Golf: Toadstool Tour, Mario Kart: Double Dash!!, Mario Kart Tour, Mario Kart 8 Deluxe, Mario Superstar Baseball e Mario Strikers Charged Football. È apparso anche nei giochi di Mario e Sonic ai giochi olimpici di Londra 2012.
Una boss simile a lui chiamato Dino Piranha appare in Super Mario Galaxy e Super Mario Galaxy 2.
Re Boo