絶対定量（ぜったいていりょう、）とは、リアルタイムPCR（qPCR）において、試料中の標的核酸量を既知量の標準物質に基づいてコピー数や濃度などの量として求める定量方法である。一般には、既知量の標準物質から作成した標準曲線に未知試料のCq値（Ct値）を当てはめて標的量を算出する方法が用いられる。

概要 qPCRにおける絶対定量では、既知量の標準物質を段階希釈して得られたCq値から検量線を作成し、未知試料のCq値を補間することで標的核酸のコピー数または濃度を求める。この方法は一般に標準曲線法による絶対定量と呼ばれる。

相対定量が基準試料などに対する標的量の比を求めるのに対し、絶対定量では既知量の標準物質との比較に基づいてコピー数や濃度として結果を表すことができる。ただし、得られる定量値の正確さは標準物質に付与された値の正確さ、希釈操作、PCR効率などに依存する。

原理 リアルタイムPCRでは、PCR反応の進行に伴う蛍光シグナルを各サイクルで測定し、設定された定量閾値を超えるサイクルをCq値（quantification cycle、Ct値ともいう）として求める。標的核酸の初期量が多いほど少ない増幅サイクルで閾値に到達するため、Cq値は小さくなる。

標準曲線法では、量が既知の標準物質を段階希釈して複数の濃度系列を作成し、それぞれについてqPCRを行う。Cq値を縦軸、標的核酸量または濃度の常用対数を横軸としてプロットして回帰直線を求め、未知試料のCq値をこの標準曲線に当てはめることで標的核酸の量を算出する。

標準曲線 標準曲線は、既知量の標準物質を段階希釈して得られる濃度系列についてqPCRを行い、そのCq値と標的量との関係から作成する。一定の定量範囲内では、Cq値と標的量の対数との間にほぼ直線的な関係が得られる。

標準曲線の傾きからはPCRの増幅効率を評価することができ、増幅効率は一般に次式で求められる。

理想的にPCR産物が各サイクルで2倍となる場合、増幅効率は100%であり、標準曲線の傾きは約−3.32となる。実際の定量では、標準曲線の直線性、増幅効率、測定値のばらつき、および定量可能な範囲を評価する必要がある。

MIQE 2.0では、標準曲線によるPCR効率の評価に際して、標準物質の希釈系列を定量範囲にわたって設定し、各濃度について技術的反復測定を行うことが推奨されている。また、定量値は定量下限（LLOQ）から定量上限（ULOQ）までの直線範囲内で報告することが求められている。

標準物質 絶対定量の正確さは、標準物質の量がどの程度正確に決定されているかに依存する。標準物質にはプラスミドDNA、精製PCR産物、合成核酸、in vitro転写RNAなどが用いられる。

DNA標的の場合、標準物質の濃度と分子量からコピー数を算出することができる。ただし、プラスミドDNAなどに不純物が含まれている場合には濃度測定値が過大となり、コピー数の算出に系統的な誤差を生じる可能性がある。また、希釈系列の作製時のピペッティング誤差や希薄な核酸の吸着・分解も定量結果に影響する。

RNAを対象とするRT-qPCRでは、逆転写反応そのものの効率が定量値に影響する。このためRNAの絶対コピー数を求める場合には、DNA標準では逆転写工程を評価できないことから、RNA標準を用いることが適切とされる。

コピー数の算出 標準曲線から得られた回帰式を用いることで、未知試料のCq値に対応する初期標的量を求めることができる。標準物質にコピー数が付与されている場合には、結果をPCR反応あたりのコピー数として表すことができる。

元の試料について単位体積あたりのコピー数などを求める場合には、核酸抽出時の体積、PCR反応へ添加した試料量、希釈倍率などを考慮して換算する必要がある。このため、試料調製からPCRまでの各工程を適切に記録することが定量値の再現性を確保する上で重要となる。

検出限界と定量範囲 qPCRでは、検出限界（limit of detection; LOD）と定量下限（lower limit of quantification; LLOQ）を区別する必要がある。検出限界は標的核酸の存在を一定の確率で検出できる最低量を示すのに対し、定量下限は所定の精度で量を定量できる最低量を示す。

特に低コピー数領域では、PCR反応液に含まれる標的分子数そのものの確率的なばらつきに加え、ピペッティング、PCR効率、試料中の阻害物質などの影響が相対的に大きくなる。このため、標的を検出できても信頼できる定量値を得られるとは限らない。MIQE 2.0では、各標的について検出限界と定量可能なダイナミックレンジを明示し、定量値を妥当性が確認された範囲内で解釈することが推奨されている。

標準曲線を用いない絶対定量 qPCRによる絶対定量では標準曲線法が一般的であるが、MIQE 2.0では、各反応のCq値、定量閾値およびPCR増幅効率から効率補正した標的量を算出し、それを単一の既知量標準と比較して絶対コピー数へ換算する方法も記載されている。この方法では段階希釈系列の作製を必要とせず、希釈操作に伴う誤差を低減できる場合がある。

なお、デジタルPCR（dPCR）では反応液を多数の微小反応区画に分配し、陽性・陰性反応の割合から標的分子数を推定するため、qPCRの標準曲線を必要としない。

応用 絶対定量は、ウイルスなどの病原体核酸量の測定、遺伝子コピー数の解析、プラスミドDNAや標準物質の定量、環境試料中の微生物量の評価など、標的核酸量をコピー数や濃度として表す必要がある解析に用いられる。qPCR自体は、臨床診断、農業、環境モニタリング、法科学、規制試験など幅広い分野で利用されている。

絶対値として結果を表せることは実験間の比較に有用であるが、その比較可能性は使用する標準物質の正確さ、測定系の妥当性、試料処理、PCR効率などに左右される。そのため、「絶対定量」であること自体が異なる実験室間の測定値の一致を保証するものではない。

脚注

関連項目 リアルタイムPCR Ct値 相対定量 デジタルPCR