PCR効率

PCR効率（ピーシーアールこうりつ、英: PCR efficiency）とは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において、1サイクルごとに標的核酸がどの程度増幅されるかを表す指標である。特にリアルタイムPCR（qPCR）では、増幅反応の評価や核酸量の定量に用いられる重要なパラメータの一つとなっている。

PCR効率を 、反応開始時の標的量を とすると、一定の効率で増幅が進む単純なモデルでは、 サイクル後の標的量 は と表すことができる。各サイクルで標的量が2倍になる理想的な反応では 、すなわちPCR効率は100%となる。ただし、PCR効率の表記法は文献によって一定ではない。増幅倍率そのものを効率として表し、理想値を2とする場合もあるため、数値を比較する際には定義を確認する必要がある。

算出法 標準曲線による推定 qPCRでは、既知量の標的核酸を段階希釈し、その初期量の常用対数を横軸、定量サイクル（Cq）を縦軸として標準曲線を作成する方法が広く用いられる。回帰直線の傾きを とすると、PCR効率は

として算出できる。100%の効率では傾きは約−3.32となる。

2025年に改訂されたMIQE 2.0では、標準曲線を用いる場合、希釈系列の各段階について理想的には少なくとも3回の技術的反復を行い、4〜5桁程度の濃度範囲を含めることが推奨されている。また、効率の推定値だけでなく、その信頼区間を示し、定量下限と定量上限の間にある線形範囲で評価することが求められている。

増幅曲線による推定 PCR効率は、標準曲線を用いず、個々の反応から得られる増幅曲線を解析して推定することもできる。Ramakersらは、指数増幅期における蛍光強度の対数値とサイクル数との間で線形回帰を行い、各反応のPCR効率と初期量を求める方法を報告した。この方法は、後にLinRegPCRとして実装された。

Ruijterらはさらに、蛍光のベースライン推定に生じる誤差がPCR効率の推定値に直接反映され、その影響が初期量や試料間の量比の計算へ指数的に伝播することを示した。LinRegPCRでは、指数増幅期に相当するデータを用いて個々の反応の効率を推定し、同一アンプリコンについて得られた値から平均効率を求めて定量に利用する。

定量解析との関係 実際のPCR効率は、反応条件や標的配列、プライマーと鋳型との適合性、阻害物質などの影響を受ける。実際の効率が理想値から外れているにもかかわらず、すべての反応で100%の増幅を仮定すると、サイクル数の増加に伴って定量値の偏りが大きくなる場合がある。

このため、PCR効率を考慮した相対定量法も開発されている。Pfafflが2001年に報告した方法では、標的遺伝子と参照遺伝子それぞれの増幅効率を計算に組み込んで発現量比を求める。MIQE 2.0でも、Cq値をそのまま定量値として扱うのではなく、PCR効率を補正した標的量へ変換して解析することが推奨されている。

解釈上の注意 100%は、1サイクルごとに標的量が正確に2倍となる場合に対応する理想値である。一方、標準曲線から100%を超える効率が算出されることもある。MIQE 2.0では、連続希釈時のピペット操作や校正に由来する系統誤差によって、100%を超える見かけ上の効率が生じ得ることが指摘されている。また、試料中にPCR阻害物質が存在する場合、希釈によって阻害物質も同時に薄まるため、標準曲線から求めた効率が実際より高く見積もられることがある。

そのため、PCR効率は単一の数値や一定の許容範囲だけで判断するのではなく、推定方法、信頼区間、標準曲線の線形範囲、反応阻害の有無などと併せて評価する必要がある。

関連項目 ポリメラーゼ連鎖反応 リアルタイムPCR ヤン・M・ルイター LinRegPCR

出典