thumb|Microscópio de fluorescência
O microscópio de fluorescência é uma variação do microscópio de luz ultravioleta que permite a observação da fluorescência de objetos, através da emissão de raios de um determinado comprimento de onda. Essa tecnologia contribuiu significativamente para o estudo da biologia celular. A imagem é produzida pela radiação eletromagnética emitida pelas moléculas no estado excitado, que possui maior comprimento de onda.
Em geral, a fluorescência é a propriedade que algumas substâncias têm de emitir radiação com maior comprimento de onda, após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda. Desse modo, certas substâncias, depois de absorverem luz ultravioleta, emitem radiação no espectro visível. Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se colocar filtros apropriados debaixo do condensador e por cima das objetivas.
Este microscópio é geralmente utilizado para detectar substâncias com autofluorescência, como por exemplo a vitamina A; ou substâncias marcadas com fluoróforo, que poderão ser conjugados com anticorpos para localizar e identificar moléculas individuais que reagem com o anticorpo. Esta aplicação é designada por imunofluorescência, sendo uma das mais importantes no contexto da microscopia de fluorescência.
História Fluorescência A sua descoberta é atribuída a Nicolás Monardes (1577), um médico e botânico espanhol. A descrição da opalescência azul surgiu a partir de uma infusão de água e de madeira de uma pequena árvore mexicana. No entanto, foi Bernardino de Sahagún, um missionário franciscano, que descreveu esta propriedade da madeira (já antes observada pelos astecas).
Esta madeira (Lignum nephriticum) foi muito popular na Europa dos séculos XVI e XVII, devido às suas propriedades medicinais no tratamento das maleitas renais. O inglês John Frampton também a descreveu como sendo “uma madeira branca que dá uma cor azul” quando colocada em água.
Em 1646, o padre jesuíta alemão Athanasius Kircher escreveu um livro no qual descreveu a sua observação sobre este fenômeno. Segundo ele, a luz que atravessava a infusão aquosa desta madeira apresentava uma cor amarelada, enquanto a luz refletida por esta solução apresentava uma cor azul.
Em 1670, Robert Boyle investigou este fenômeno mais profundamente, descobrindo que após muitas infusões a madeira perdia a sua capacidade de conferir uma cor à água. Concluiu, desta forma, que havia algum sal essencial na madeira responsável por este efeito, e que a adição de um ácido abolia a cor, enquanto a adição de uma base permitia restaurá-la. Boyle foi, assim, o primeiro a utilizar a fluorescência como indicador de pH.
Apesar de nos séculos seguintes não ter sido muito estudada, em 1915 Safford identificou as espécies que produziam esta madeira como Eysenhardtia polystachya. Mais recentemente, foram isolados alguns glucosilhidroxialcanos altamente fluorescentes a partir desta planta.
Outros estudos recentes, de Ulises Acuna, indicaram que a emissão azul original observada pelos astecas era provavelmente devida à conversão da coatline B, sob condições ligeiramente alcalinas, num composto com forte emissão de radiação azul (com pico máximo de emissão a 466 nm), que fazia lembrar a fluoresceína.
Ainda no século XVII, em 1612, Galileu Galilei descreveu a emissão de luz a partir de uma pedra famosa, a “Bolognian stone” – fosforescência.
Em 1833, David Brewster descreveu que quando um feixe de luz branca passa através de uma solução alcoólica de folhas é observado um feixe de luz vermelha – fluorescência da clorofila.
Doze anos depois, em 1845, John Herschel observou pela primeira vez a fluorescência a partir do sulfato de quinina, designando este fenômeno de dispersão epipólica. Em 1852, George Gabriel Stokes denominou este mesmo fenómeno de reflexão dispersiva. Na sua experiência, Stokes usou um prisma para dispersão do espectro da luz solar e iluminação de uma solução de quinina. Este verificou que só obtinha algum efeito quando a solução era colocada na região ultravioleta do espectro. Desta forma, a fluorescência apresenta um comprimento de onda superior ao da fonte de excitação (luz ultravioleta) – “desvio de Stokes”.
Em 1882, Paul Ehrlich usou a uranina (o sal sódico da fluoresceína) para observar a secreção do humor aquoso no olho. Esta foi a primeira utilização in vivo da fluorescência.
Em 1887, K. Noack publicou um livro no qual listava 660 compostos organizados de acordo com a cor da sua fluorescência.
Dez anos depois, R. Meyer utilizou o termo “fluoróforo” para descrever os grupos químicos que se encontravam associados à fluorescência. Este termo é análogo ao termo “cromóforo”, o qual foi usado pela primeira vez em 1876 por O. N. Witt para descrever grupos químicos associados à cor.
Microscópio de fluorescência As primeiras pesquisas que deram origem à invenção do microscópio de fluorescência atribuem-se ao cientista alemão August Köhler.
Köhler realizou experiências com radiação ultravioleta que, devido ao seu comprimento de onda mais curto, poderiam contribuir para o incremento do poder de resolução, face à já observada na microscopia óptica. Seria a partir destas pesquisas que surgiria o microscópio de ultravioleta (UV) (entre 1901 e 1904).
Em 1904, descobriu-se que o tecido demonstra fluorescência quando irradiado por luz ultravioleta, sendo este fenómeno conhecido como autofluorescência. Esta propriedade pesquisada na investigação de bactérias, protozoários, plantas, tecidos animais e em várias substâncias orgânicas como, por exemplo, a albumina, a elastina e a queratina.
No século XX, nomeadamente em 4 de abril de 1908, August Köhler e Henry Siedentopf, da companhia Carl Zeiss, apresentaram em um curso de microscopia dos primeiros microscópios de fluorescência, a partir do modelo de microscópio de UV.
Em 1914, Stanislaus von Prowazek utilizou o microscópio de fluorescência para estudar a ligação dos corantes às células vivas, chegando à conclusão que secções de tecido corados poderiam ser examinados recorrendo ao microscópio de fluorescência, caso os corantes utilizados fossem fluorescentes. Estes corantes foram denominados fluorocromos, de modo a distingui-los dos diacromos (tintas coloridas que se tornam visíveis por absorção de luz).
Contudo, o principal fator impulsionador para a microscopia de fluorescência deve-se ao desenvolvimento de técnicas de conjugação de fluorocromos a anticorpos por Coons e seus colaboradores, em 1941. A microscopia de fluorescência forneceu uma maior sensibilidade necessária para a demonstração das reações anticorpo-antígeno in situ. A técnica de Coons marcava assim a génese da Imunofluorescência.
Com estes novos métodos, os microscópios de fluorescência tornaram-se acessíveis, levando à sua utilização em várias áreas.
Evolução do microscópio de fluorescência A evolução tecnológica ligada ao microscópio de fluorescência assume carácter multidisciplinar uma vez que se cruza com a física, a óptica, a química, a engenharia genética e a biologia. Todas estas ciências deram um contributo fulcral para que fosse possível visualizar substâncias fluorescentes acopladas a proteínas e assim, aumentar a compreensão da actividade celular.
Cientistas como Wilhelm Conrad Roentgen, que venceu o primeiro Prémio Nobel da Física, e Alexandre Edmond Becquerel, fizeram as primeiras observações sobre a fluorescência. Antoine Henri Becquerel herdou do seu pai a colecção de minerais e compostos fluorescentes que, em associação com as conclusões da Roentgen, conseguiu demonstrar que tanto os raios-X como a fluorescência exigem uma contínua fonte de energia para emitir radiação.
A principal descoberta, que deu renome à microscopia de fluorescência, relaciona-se com uma proteína com autofluorescência de cor verde – proteína verde fluorescente (GFP, do inglês green fluorescent protein) – presente em organismos vivos. Foi identificada e isolada na década de 60 pelo biólogo marinho Osamu Shimomura a partir dos cnidários Aequorea victoria, sendo identificada como um brilho verde causado por uma proteína. Posteriormente, Douglas Prasher estudou o gene repórter da GFP. A estrutura desta proteína só foi devidamente caracterizada em 1996 por Martin Chalfie, Roger Y. Tsien e Osamu Shimomura.
Este conhecimento foi um marco importante para a evolução da área, promovendo uma nova classe de métodos de marcação de estruturas através da microscopia de fluorescência.
Um elemento-chave para a evolução da microscopia, em geral, foi a transição para a imagem digital, na década de 1990, com aquisição de instrumentos de alta sensibilidade e de computadores com hardware avançado, a preços acessíveis.
Os microscópios de fluorescência têm evoluído a uma velocidade espantosa ao longo da última década, aliada principalmente ao rápido avanço na tecnologia laser e do computador baseado em análise de imagem.
Contribuição para o conhecimento A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais utilizada para o estudo da dinâmica de células vivas, devido à sua capacidade de isolar diferentes proteínas com um alto grau de especificidade, sendo a sua sensibilidade suficientemente elevada para detectar cerca de 50 moléculas/µm3.
A marcação de diferentes moléculas com fluorocromos distintos (diferentes cores), permite a avaliação simultânea de vários tipos de moléculas. A combinação destes fatores confere à microscopia de fluorescência uma clara vantagem sobre outras técnicas de observação estrutural, nomeadamente microscopia óptica, tanto in vitro como in vivo.
Através do desenvolvimento de sondas fluorescentes e novos microscópios de alta resolução, a biologia de imagem entrou numa nova era e tem, atualmente, um profundo impacto sobre a forma como a investigação é conduzida nas ciências da vida. Os cientistas têm vindo a depender cada vez mais da observação microscópica, sendo possível visualizar componentes e processos subcelulares in vivo, tanto ao nível estrutural como funcionalmente.
Atualidade A importância da microscopia de fluorescência teve o seu reconhecimento máximo com a atribuição em 2008 do Prémio Nobel de Química, concedido aos cientistas que identificaram a estrutura da GFP.
Perspectivas futuras A investigação de métodos de processamento de sinais biológicos é apenas o ponto de partida para a evolução desta área, sendo que ainda não estão claramente formulados os campos a desenvolver.
No entanto, será previsível que os principais desafios na microscopia de fluorescência passem por métodos mais sensíveis e com maior amplificação de sinal.
A necessidade de resposta à investigação por parte da comunidade científica fomentará também a necessidade do fabrico de microscópios de fluorescência tecnologicamente mais avançados, assim como os acessórios adequados aos mesmos, o que constituirá uma importante contribuição para a pesquisa no âmbito dos organismos vivos.
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Na microscopia de fluorescência, a amostra que se quer estudar é ela própria a fonte de luz, sendo a técnica usada para estudar amostras que possam emitir fluorescência.
O microscópio de fluorescência baseia-se no fenómeno que certo material emite energia detectável como luz visível quando irradiado com luz de um comprimento de onda específico. A amostra pode emitir fluorescência na sua forma natural, como a clorofila e alguns minerais, ou através de tratamento com químicos fluorescentes (fluoróforos).