Нуклеофозми́н (, также известен как нуматри́н, NPM1, NPM, NO38, я́дрышковый фосфопротеи́н B23) — ядрышковый белок, у человека кодируется геном NPM1, локализованным на 5-й хромосоме. Нуклеофозмин перемещается между ядром и цитоплазмой и действует как многофункциональный шаперон нуклеиновых кислот, принимающий участие в таких процессах, как биогенез рибосом, ремоделирование хроматина, регуляция митоза, поддержание стабильности генома, репарация ДНК и транскрипция. Нарушения в работе нуклеофозмина могут приводить к развитию злокачественных новообразований и других заболеваний; в частности, мутации, затрагивающие его ген, приводят к развитию острого миелоидного лейкоза.
Нуклеофозмин был впервые описан вместе с нуклеолином (С23) Busch и коллегами в 1973 году.
Структура
Ген и изоформы У человека ген NPM1 располагается на 5-й хромосоме в локусе 5q35.1 и содержит 12 экзонов. Известно более дюжины псевдогенов этого гена. Человеческий нуклеофозмин (основная изоформа) состоит из одной полипептидной цепи длиной 294 аминокислотных остатка и имеет массу 32 575 дальтон. Нуклеофозмин высококонсервативен среди таких организмов, как человек, грызуны, куры и рыбы. Известны три изоформы нуклеофозмина: полноразмерная NPM1.1, NPM1.2, образующаяся в результате альтернативного сплайсинга, и NPM1.3. мРНК NPM1.2 и NPM1.1 отличаются по 3'-концевому экзону, причём NPM1.2 короче основной изоформы (состоит из 259 аминокислотных остатков). О функциях и особенностях экспрессии недавно описанной изоформы NPM1.3 известно мало, однако установлено, что у неё отсутствует внутренний участок в С-концевом домене.
Доменная организация Нуклеофозмин относится к семейству белковых шаперонов гистонов типа нуклеоплазмина (NPM-белков), к которому, кроме него, принадлежат ещё два белка (NPM2 и ). Эти белки обнаружены у млекопитающих, рыб, птиц, мух, но не у бактерий и дрожжей. Отличительной чертой NPM-белков является наличие консервативного N-концевого домена олигомеризации. Эти белки функционируют как и могут собираться в декамеры при расположении двух пентамеров друг над другом с образованием структуры, напоминающей сэндвич. Считается, что в таком виде они способны связываться с гистонами. Показано, что для сборки пентамеров дисульфидные связи, образуемые остатками цистеина, не играют существенной роли. В 2014 году было также показано, что N-концевой домен олигомеризации проявляет структурный полиморфизм при переходе между разными конформационными состояниями NPM1: от высокоупорядоченного пентамера до неупорядоченного мономера. Равновесие между мономерной и пентамерной формами NPM1 регулируется его фосфорилированием и связыванием с другими белками. Так, фосфорилирование смещает равновесие в сторону мономеров.
NPM1 содержит участки, необходимые для олигомеризации, шаперонной активности, связывания с нуклеиновыми кислотами, а также ядерной локализации. Функционированию NPM1 как шаперона вполне соответствует чрезвычайная термическая и химическая стабильность его N-концевого домена. Первые 15 аминокислот составляют участок, обогащённый метионином, однако функциональное значение этого участка неизвестно. Возможно, он нужен для усиления инициации трансляции, поскольку метиониновые кодоны входят в хорошие последовательности Козак. Хотя этот богатый метионином участок не является необходимой частью белка, он может оказывать влияние на его конформацию. NPM1 содержит три участка, обогащённых отрицательно заряженными (кислыми) аминокислотными остатками (А1, А2 и А3). Возможно, кислые участки играют роль в нейтрализации заряда белка. Кор NPM1, содержащий А1, может в одиночку слабо связываться с гистонами и , однако для связывания с гистонами и необходимы кислые участки А2 и А3 (их отрицательный заряд имитирует отрицательный заряд сахарофосфатного остова ДНК и РНК). С-концевой домен NPM1 содержит группы положительно заряженных (основных) аминокислот, за которыми следует участок, обогащённый аминокислотами с ароматическими радикалами. Этот участок участвует в связывании с нуклеиновыми кислотами, связывании с АТР, переносе гистонов, обладает рибонуклеазной активностью и содержит сигнал ядрышковой локализации (NoLS). Кроме того, С-концевой домен нуклеофозмина способен специфично распознавать G-квадруплексы в ДНК.
В 2015 году было показано, что α-спираль Н2 (остатки 264—277) из С-концевого домена нуклеофозмина может формировать токсичные амилоидоподобные агрегаты с фибриллярной β-слоистой структурой при физиологических условиях.
На рисунке ниже представлена схема строения NPM1.
Олигомеризация Основный участок Met A1 A2 NLS A3 HeD/DBD NoLS 1 − − 294
Посттрансляционные модификации Нуклеофозмин подвергается таким посттрансляционным модификациям, как фосфорилирование, ацетилирование, убиквитинирование и сумоилирование. NPM1 считается ядрышковым фосфопротеином и может фосфорилироваться несколькими киназами — такими, как (CKII), polo-подобная киназа 2 (Plk2), и комплекс /CDK2. Фосфорилирование нуклеофозмина оказывает влияние на его активность, олигомеризацию, способность к перемещениям внутри ядра и клетки в целом, а также локализацию в клетке, в частности, фосфорилирование может усиливать его сродство к компонентам рибосомы и, таким образом, влиять на биогенез рибосом. Так, CKII фосфорилирует NPM1 по остатку S125, который находится в одном из кислых участков. Этот участок необходим для работы NPM1 как шаперона, и фосфорилирование по S125 вызывает диссоциацию субстрата от NPM1. Фосфорилирование по этому остатку, помимо того, уменьшает способность NPM1 к внутриклеточным и внутриядерным перемещениям. Фосфорилирование казеинкиназой II усиливает связывание NPM1 с сигналами ядерной локализации (NLS) и белка ВИЧ. Конкретные сайты сумоилирования NPM1 точно не установлены, но сумоилирование NPM1 может влиять на его локализацию и стабильность. может убирать «метку» SUMO с NPM1. Убиквитиновые «метки» с NPM1 удаляет фермент , стабилизируя NPM1, в то время как отсутствие USP36 приводит к дефектам в биогенезе рибосом. Интересно, что NPM1 может сам доставлять USP36 в ядрышко путём непосредственного связывания. Ацетилирование NPM1 посредством оказывает двойной эффект: оно стимулирует перемещение NPM1 из ядрышка в нуклеоплазму и, помимо этого, необходимо для стимуляции РНК-полимераза II-зависимой транскрипции посредством NPM1. При ВИЧ-инфекции, вызванной ВИЧ-1, уровень ацетилирования NPM1 повышается.
Внутриклеточная локализация NPM1 курсирует между ядром и цитоплазмой и содержит сигналы как ядерного импорта (NLS), так и (NES). Перемещение NPM1 между ядром и цитоплазмой необходимо для осуществления некоторых его функций, в частности, для экспорта из ядра и контроля удвоения центросом. NPM1 может доставлять в ядрышко небольшие основные белки. В частности, он может связываться с вирусными и ядрышковыми белками Rev, Rex, и и способствовать их локализации в ядрышке. В ядре NPM1 располагается в основном в ядрышке, хотя некоторое его количество присутствует в нуклеоплазме. В ходе митоза он обнаруживается в остатках ядрышка в перихромосомном слое и в области митотического веретена. В ядрышке NPM1 находится в основном в гранулярном компоненте, где созревают прерибосомные частицы, а также на границе плотного фибриллярного компонента.
Последовательности и молекулярные механизмы, обеспечивающие ядрышковую локализацию NPM1, не вполне ясны, однако известен ряд ключевых моментов. Так, мутации, разрушающие структуру мономеров и олигомеров, заметно снижают накопление этого белка в ядрышке. Кроме того, показано, что для ядрышковой локализации NPM1 совершенно необходимы два остатка триптофана W288 и W290, которые, предположительно, обеспечивают правильную вторичную структуру для связывания с нуклеиновыми кислотами и тем самым облегчают связывание. Показано, что для ядрышковой локализации и стабильности NPM1 необходимы также два остатка лизина K263 и K267. NMP1 определённо содержит сигнал ядерной локализации, однако имеются разногласия относительно того, какой именно мотив в центральном участке выполняет эту роль. Изоформа NPM1.2 обнаруживается в клетках в небольших количествах, причём в цитоплазме и нуклеоплазме, что свидетельствует в пользу необходимости С-конца для ядрышковой локализации. В настоящее время считается, что механической основой удержания нуклеофозмина в ядрышке является сильное связывание его С-конца с G-квадруплексами в области рДНК.
Рассматриваются несколько возможных кандидатов на роль сигнала ядерного экспорта, который у NPM1 располагается в домене олигомеризации. Первый из них — последовательность 42-LSLRTVSL-49, где мутации в положениях L42A и L44A блокируют ядерный экспорт NPM1. Второй мотив — 94-ITPPVVLRL-102, где мутация L102A блокирует не только ядерный экспорт, но и вообще перемещение NPM1 между ядром и цитоплазмой.
Большое влияние на внутриклеточную локализацию NPM1 оказывает малая GTPаза Rac1. В клетках, экспрессирующих активную Rac1, NPM1 перемещается из ядра в цитоплазму. Впрочем, NPM1 способен отрицательно регулировать Rac1.
Действие на клеточном уровне Нуклеофозмин имеет множество разнообразных клеточных функций, которые подробно освещены ниже.
Шаперон гистонов и рибосом NPM1 обладает признаком белковых шаперонов: он связывается с денатурированными белковыми субстратами. В условиях in vitro он препятствует агрегации и тепловой денатурации некоторых белков. NPM1 может связываться с прерибосомными частицами (в частности, ) и поэтому может выполнять роль фактора сборки рибосом. В условиях in vitro он способствует разрезанию пре-рРНК и функционирует как эндорибонуклеаза, обеспечивающая созревание транскрипта рРНК. NPM1, кроме того, участвует в осуществлении контроля качества созревающих рРНК. Нокдаун NPM1 при помощи малых интерферирующих РНК нарушает процессинг пре-РНК (в частности, в 28S рРНК), а блокирование его перемещения между ядром и цитоплазмой подавляет экспорт рибосомных субъединиц, что приводит к снижению скорости роста клеток. NPM1 может непосредственно взаимодействовать с рядом рибосомных белков, в частности, RPL5, и . NPM1 образует комплекс с другим белком своего семейства, NPM3, причём NPM3 негативно регулирует активность NPM1 при биогенезе рибосом. Интересно, что варианты NPM1, лишённые домена связывания с нуклеиновыми кислотами, также подавляют биогенез рибосом подобно NPM3. Таким образом, NPM1 способствует росту и пролиферации клеток, участвуя в нескольких стадиях биогенеза рибосом.
В условиях in vitro NPM1 может собирать нуклеосомы и деконденсировать ДНК сперматозоидов. Есть подтверждения функционирования NPM1 в ядрышке в качестве шаперона гистонов. Любопытно, что in vitro NPM3 подавляет способность NPM1 к сборке нуклеосом.
Ядрышковый супрессор опухолей (далее ARF) является одним из важнейших белков, с которыми связывается NPM1. Повышение количества ARF в клетке препятствует перемещению NPM1 между ядром и цитоплазмой, способствует его деградации и замедляет созревание 28S рРНК. В нормальных условиях NPM1 способствует ядрышковой локализации и стабильности ARF.
Репликация, транскрипция и репарация ДНК NPM1 задействован в процессах репликации, транскрипции, рекомбинации и репарации ДНК. Он может участвовать в ремоделировании хроматина, воздействуя на сборку нуклеосом или регулируя модификации гистонов посредством привлечения соответствующих ферментов.
NPM1 связывается с белком ретинобластомы (pRB) и в условиях in vitro стимулирует работу ДНК-полимеразы α, поэтому он может влиять на репликацию ДНК. Кроме того, in vitro NPM1 стимулирует репликацию ДНК аденовируса.