Секвени́рование ДНК одино́чных кле́ток () — подход, позволяющий получить данные о последовательности ДНК отдельной клетки с помощью секвенирования и, следовательно, выявлять различия между отдельными клетками одноклеточных организмов, органов, тканей и клеточных субпопуляций многоклеточных организмов. Подход позволяет анализировать функциональные особенности клетки в контексте микроокружения. Секвенирование генома единичной клетки включает несколько шагов: выделение одной клетки, полногеномная амплификация, создание библиотек и секвенирование ДНК с использованием методов секвенирования нового поколения.

С появлением разнообразных методов секвенирования возникла возможность устанавливать последовательность геномной ДНК. Однако большинство данных на текущий момент получены при секвенировании образцов геномной ДНК, выделенных из популяций микроорганизмов или клеточных субпопуляций многоклеточных организмов. Однако известно, что разнообразие внутри обеих групп может быть существенным, так как сами клетки вносят разный вклад в существование популяции или организма.

Секвенирование генома единичной клетки позволяет перевести изучение генома на клеточный уровень. Сегодня это помогает решать такие задачи, как секвенирование некультивируемых микроорганизмов, изучение генетического мозаицизма в нормальных и патологических случаях, выявление и изучение вклада клеточных субпопуляций опухолей в развитие рака и возникновение устойчивости к лечению.

Технологические задачи Перед секвенированием ДНК одиночных клеток стоят задачи физического выделения отдельных клеток, выбора метода амплификации с наименьшей вероятностью внесения ошибок для получения достаточного количества материала и выбора способа секвенирования. Изолирование отдельных клеток Первым шагом в изолировании клеток является создание суспензии жизнеспособных клеток, не связанных друг с другом. Целью изолирования может быть как случайный выбор клеток для создания репрезентативной выборочной совокупности при анализе состава субпопуляций, так и целенаправленный поиск определённых клеток. При исследовании твердых тканей необходима предварительная механическая или химическая диссоциация образца, при этом условия диссоциации должны одинаково действовать на все субпопуляции клеток тканей. Это необходимо для создания несмещенной относительно исходного набора клеток выборки, где сохраняется изначальная представленность клеток, что может быть важно для анализа состава субпопуляций. Стоит учитывать, что условия диссоциации нормальных и нездоровых тканей могут различаться, поэтому на данном этапе важно подобрать соответствующие условия. Работа с цельными образцами тканей также возможна, например, с помощью лазерной захватывающей микродиссекции.

После получения суспензии можно приступать к изолированию клеток методами серийного разведения, микропипетирования, разведения в микроячейках, с использованием оптического пинцета. Метод проточной флуоресцентной цитометрии может использоваться для отделения клеток с определёнными флуоресцентными свойствами, которые могут быть как естественными, так и введены экспериментатором. Большое развитие в последнее время получили автоматизированные методы микроманипуляции, в том числе изолирование клеток на чипах с использованием технологий микрофлюидики; взятие нанобиопсий уже позволяет исследовать ДНК отдельных органелл. Изолированные клетки впоследствии подвергаются лизису.

Полногеномная амплификация Следующий шаг — полногеномная амплификация (), — служит для наработки такого количества ДНК, которого достаточно для детекции сигнала и его выделения из шума в дальнейшем при секвенировании. При этом желательно минимизировать внесение таких артефактов, как предпочтительная амплификация простых последовательностей, введение случайных мутаций и формирование химерных последовательностей. За последнее время появился набор возможностей для решения этой задачи. Использование ПЦР не оправдало себя ввиду, например, повышенной частоты введения ошибок термостабильными полимеразами. Поэтому наибольшего распространения добились изотермические и гибридные методы, такие как метод () и ().

MDA MDA позволяет быстро амплифицировать ДНК, не задействуя ПЦР. Метод основан на использовании фаговой полимеразы phi29, которая характеризуется повышенной процессивностью (может синтезировать участки длиной свыше 10 килобаз без диссоциации) и низкой частотой ошибок (1 на 106−107 пар оснований). Реакция происходит следующим образом: гексамерные праймеры отжигаются на матрице, элонгируются посредством полимеразы; когда фермент встречает другой праймер (который также элонгируется), то он вытесняет (замещает) его и продолжает свой путь по матрице. Замещенный новосинтезированный участок служит местом посадки новых праймеров и становится матрицей. Таким образом формируется ветвистое дерево, где синтез происходит на каждой ветви. В конце процедуры полимераза ингибируется, добавляется нуклеаза S1 для отщепления ветвей в местах ветвления и для достраивания образующихся одноцепочечных участков.

Метод имеет ряд проблем, таких как потеря аллелей, предпочтительная амплификация и взаимодействия между праймерами. Первая проблема возникает вследствие случайной амплификации только одного из аллелей в гетерозиготах, в результате чего гетерозиготы неверно определяются как гомозиготы. Из-за высокой частоты проявления этого эффекта (0 — 60 %) уменьшается точность . Вторая проблема заключается в сверхамплификации одного аллеля по сравнению с другими. Взаимодействия между гексамерными праймерами происходят вследствие случайного характера последовательностей; их можно значительно уменьшить, введя ограничения при синтезе этих праймеров.

MALBAC MALBAC — гибридный линейный метод полногеномной амплификации. Основа метода — специальные праймеры: они имеют длину 35 нуклеотидов, 27 из которых одинаковы во всех праймерах (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), а 8 оставшихся нуклеотидов варьируются. Весь процесс амплификации описывается следующим образом:

Плавление (94 °С) двухцепочечной ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов. Охлаждение (0 °С), добавление праймеров и полимеразы. Отжиг праймеров в случайных местах на матрице. ДНК-полимераза Bst удлиняет праймеры с образованием полуампликона при 64 °С. Все встречные праймеры смещаются с матрицы. Плавление (94 °С), отделение полуампликона от матрицы. Охлаждение (0 °С), добавление праймеров и полимеразы. Праймеры эффективно связываются и с матрицей, и с полуампликоном. ДНК-полимераза Bst удлиняет праймеры при 64 °С. На исходной матрице синтезируются полуампликоны, на полуампликонах, полученных ранее, синтезируются полные . Плавление (94 °С). Образование петель (58 °С): у полных ампликонов 3' и 5' концы комплементарны друг другу и образуют петлю, не допуская использования полного ампликона в качестве матрицы. Повторение шагов 5—8 пять раз. ПЦР с использованием 27 общих нуклеотидов в качестве праймеров для амплификации только полных ампликонов.

Преимуществом метода является уменьшение шума, связанного с экспоненциальным характером ПЦР амплификации, благодаря введению предварительной квази-линейной амплификации. Это позволило увеличить покрытие генома (доля генома, покрытая хотя бы одним ридом), уменьшить вероятность потери аллелей и однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs). Помимо этого, на вход требуется очень небольшое количество исходной ДНК, однако любое загрязнение образцов способно значительно повлиять на результаты секвенирования.

Недостатком является то, что для избавления от ложно-положительных результатов необходимо сравнивать результаты секвенирования 2—3 клеток как из той же, так и из иной клеточных линий. При этом может теряться часть полиморфизмов, так как клетки, принадлежащие одной клеточной линии, все же имеют некоторые различия в геноме. Кроме того, используемая ДНК-полимераза bst имеет высокую частоту ошибок (1 на 105 оснований).

Сравнение методов полногеномной амплификации В последнее время было проведено несколько исследований, посвящённых сравнению этих методов. Результатом одного из исследований стал вывод о том, что MDA позволяет получить большее покрытие, чем MALBAC (84 % и 52 % соответственно), что позволяет более точно определять однонуклеотидные полиморфизмы. Однако MALBAC обеспечивает более равномерное покрытие и поэтому даёт возможность более точно выявлять вариации числа копий (CNVs). Интересно, что при секвенировании некоторых клеток уровень детекции вариаций числа копий методом MDA был сопоставим с MALBAC. Другие авторы также подтверждают разницу в покрытии между MDA и MALBAC (84 % и 72 %) и сравнительно более высокую равномерность покрытия MALBAC (коэффициент вариации 0,10 против 0,21 у MDA). Показано, что MDA даёт меньше ложно-положительных результатов, но число ложно-отрицательных результатов меняется от эксперимента к эксперименту. MALBAC даёт меньшую частоту потери аллелей (21 %), однако и покрытие его меньше, чем у MDA. В целом не ясно, какой приводит к меньшему количеству ложно-отрицательных результатов, так как MDA покрывает большую часть генома, но при этом теряет больше аллелей из-за предпочтительной амплификации только одного из аллелей в гетерозиготе.

Таким образом, MDA и MALBAC имеют набор преимуществ и недостатков, и выбор должен зависеть от поставленной задачи.

Создание библиотеки После амплификации можно приступать к приготовлению библиотек с помощью коммерческих наборов. Здесь возможно несколько вариантов: выбор определённого локуса, выбор экзома или всего генома для дальнейшего секвенирования. Каждый из этих вариантов предполагает определённые значения покрытия, склонности к ошибкам и стоимости. Выбор небольших участков позволяет сфокусироваться на областях, вносящих наибольший биологический вклад в работу изучаемой системы. При этом уменьшается цена исследования и вероятность внесения ошибок при подготовке проб. Использование позволяет уменьшить ложно-положительные результаты, хотя и ограничивает определяемые однонуклеотидные полиморфизмы теми, что присутствуют в референсном геноме. Секвенирование экзома позволяет выделить уникальные особенности клеток, однако с ростом длины секвенируемого участка растёт вероятность внесения ошибок в ходе амплификации. Использование всего генома позволяет выявить некодирующие и структурные участки, однако стоимость исследования резко возрастает, что затрудняет полногеномное секвенирование многих клеток.

ДНК из созданных тем или иным способом библиотек используется в секвенировании одним из существующих методов.

Обработка данных

Распространённые ошибки Большинство артефактов секвенирования возникают при подготовке образцов: изоляция клеток, загрязнение геномной ДНК, амплификация и создание библиотек, так как все эти шаги привносят дополнительные ошибки, приводят к потере покрытия, уменьшению однородности покрытия, смещениям в выборке при предпочтительном отборе определённых групп клеток и амплификации определённых последовательностей ДНК, являются причиной потери аллелей в гетерозиготных позициях. Следует также принимать во внимание клеточные линии, на которых проводится оптимизация всех стадий секвенирования: не все клетки диплоидны, есть и гаплоидные, и анеуплоидные популяции, и их плоидность может значительно влиять на эксперимент. Препятствием на пути сравнения различных результатов в этой области подчас является отсутствие информации об общем количестве оцененных клеток и мере оценки качества секвенирования в конкретных работах.

Однонуклеотидные полиморфизмы Однонуклеотидные полиморфизмы, согласно проекту 1000 геномов, вносят наибольшее разнообразие в геном человека: на карте гаплотипа подтверждено 38 млн однонуклеотидных полиморфизмов, 1,4 млн вставок/делеций и более 14 тыс. крупных делеций. Также предполагается, что многие комплексные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, различные виды рака, аутоиммунные заболевания могут быть связаны именно с наличием полиморфизмов.