Параспе́клы (), или паракрапинки, — класс ядерных телец, располагающихся в интерхроматиновом пространстве клеточного ядра в клетках млекопитающих. Они состоят из белков и РНК и формируются при взаимодействии длинной некодирующей РНК, известной как , и белков семейства DBHS (от ), а именно , PSPC1 и PSF/SFPQ. Параспеклы играют важную роль в регуляции экспрессии генов, обеспечивая удержание в ядре молекул РНК, содержащих двуцепочечные участки и подвергшихся редактированию аденозин → инозин (A → I). Регулируя экспрессию генов, параспеклы оказываются вовлечёнными в такие процессы, как дифференцировка клеток, ответ на стресс и протекание вирусных инфекций. Имеются данные о связи параспекл с раком и заболеваниями нервной системы.
История изучения Параспеклы были открыты в 2002 году Андерсеном и коллегами в ходе изучения протеома очищенных ядрышек клеток человека с помощью масс-спектрометрии. В ходе исследования был выделен 271 белок, из которых 30 % оказались ранее неизвестными. Более детальное изучение одного из этих новооткрытых белков показало, что он вовсе не накапливается в ядрышках, а располагается в нуклеоплазме диффузно, но сильно концентрируется в 5—20 ядерных фокусах. Оказалось, что эти фокусы не перекрываются ни с одним из ранее известных ядерных телец, и они получили название «параспеклы» из-за расположения вблизи других ядерных телец — спекл. Сам же белок получил название PSPC1 (от ).
Структура Параспеклы — это мелкие тельца неправильной формы. В зависимости от типа клеток обычно в ядре имеется от 5 до 20 параспекл. Изучение с помощью электронной и флуоресцентной микроскопии показало, что параспеклы человека имеют ширину около 360 нм (у мыши чуть меньше) и длину от 1 до 2 мкм. Достоверно существование параспекл показано только для клеток млекопитающих. У человека параспеклы отсутствуют в эмбриональных стволовых клетках и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Ортологи ключевых белков параспекл обнаруживаются у других позвоночных и беспозвоночных животных, однако длинная некодирующая РНК NEAT1, необходимая для формирования параспекл, есть только у млекопитающих, с чем, по-видимому, и связано отсутствие параспекл в ядрах других организмов. Количество и длина параспекл пропорциональны уровню экспрессии длинной изоформы NEAT1.
Последние исследования с использованием электронной микроскопии и показали, что параспеклы представляют собой цепочки слитых сферических субкомпартментов, каждый из которых имеет коровую часть и оболочку. 5'- и 3'-концы длинной изоформы NEAT1 локализуются в оболочке, а остальная часть молекулы находится в коровой части. Разные белки параспекл тоже локализуются в разных частях параспекл.
Параспеклы располагаются в интерхроматиновом пространстве, зажатые между более крупными ядерными спеклами и хроматином. Показано, что внутри параспекл РНК-полимераза II неактивна, и транскрипция, опосредованная этим ферментом, происходит только у края параспекл.
Связь параспекл с ядрышком ещё не до конца понятна, однако один из ключевых белков параспекл, PSPC1, может перемещаться между параспеклами и ядрышком. Кроме того, при подавлении работы РНК-полимеразы II белки параспекл локализуются в особых околоядрышковых кэпах.
Компоненты В параспеклах в больших количествах накапливается свыше 40 различных белков и РНК. Большинство белков параспекл связаны с транскрипцией, опосредуемой РНК-полимеразой II, и процессингом РНК. Одна из двух РНК, накапливающихся в параспеклах, называется Ctn и участвует в регуляции экспрессии генов путём удержания РНК в ядре. Вторая РНК называется NEAT1 и играет архитектурную роль, являясь необходимой для формирования и поддержания структуры параспекл. Основные компоненты параспекл перечислены в таблице ниже.
Название Класс Синонимы Комментарии P54NRB Белок NONO, NMT55, NRB54 Член семейства DBHS. Необходим для целостности параспекл в клетках HeLa Белок SFPQ Член семейства DBHS. Необходим для целостности параспекл в клетках HeLa PSPC1 Белок PSP1 Член семейства DBHS Белок PSP2, RBM14, SIP, SYTIP1 Корегулятор транскрипции/сплайсинга Белок CPSF6, HPBRII-4 Фактор разрезания, также встречается в ядерных спеклах Белок SRA1 Транскрипционный фактор, важный для регуляции развития Белок Белок-супрессор опухолей Белок WAGR Частично колокализуется с параспеклами Белок CTIP1, ZNF856 Транскрипционный фактор, содержащий мотив «цинковый палец» РНК-полимераза II Белок Также ассоциирована с ядерными спеклами и хроматином NEAT1 РНК Men ε/β, VINC-1 Длинная некодирующая РНК, необходимая для целостности параспекл Ctn РНК Специфична для мышей
Белки Важнейшими компонентами параспекл являются три белка семейства DBHS: PSF/SFPQ, NONO/P54NRB и PSPC1. Они локализуются в нуклеоплазме и в параспеклах. Чаще всего в качестве маркера для параспекл используется белок PSPC1, поскольку он в меньшей степени накапливается в нуклеоплазме. Два N-концевых РНК-связывающих мотива и С-концевой биспиральный мотив () у этих белков на 50 % совпадают по последовательности. Эти белки играют важную структурную роль в параспеклах: так, нокдаун белков P54NRB и PSF в клетках HeLa приводит к утрате параспекл. По сравнению с P54NRB и PSF, PSPC1 экспрессируется не так обильно, и его нокдаун не приводит к утрате параспекл. Эти три белка взаимодействуют друг с другом и, вполне вероятно, внутри клеток они находятся в виде гомо- или гетеродимеров. Взаимодействие друг с другом осуществляется через биспиральный мотив. Для локализации этих белков в параспеклах необходимы как домены, содержащие С-концевые биспиральные мотивы, так и домены. Члены семейства DBHS связывают одно- и двуцепочечные молекулы ДНК и РНК и участвуют во многих этапах синтеза и процессинга РНК. Кроме того, PSF и P54NRB связывают и удерживают внутри ядра транскрипты, подвергшиеся интенсивному редактированию аденозин → инозин. Они также функционируют в цитоплазме, например, PSF и P54NRB входят в состав переносящих РНК гранул в дендритах, однако только P54NRB может активно транспортироваться из ядра в цитоплазму. Интересно, что P54NRB участвует в регуляции циркадных ритмов у млекопитающих.
Белками параспекл считают такие белки, которые колокализуются в определённых ядерных локусах вместе с белками семейства DBHS, однако общая картина локализации этих белков может значительно различаться. Например, белок CFIM68 можно наблюдать в параспеклах, но он также встречается и в ядерных спеклах; в то же время РНК-полимераза II, кроме параспекл, выявляется в хроматине и ядерных спеклах. Наконец, некоторые белки обнаруживаются в параспеклах только в условиях сверхэкспрессии, например, BCL11A, WTX, WT1(+KTS) и CoAA.
Белки параспекл, не входящие в семейство DBHS, обычно являются транскрипционными факторами или корегуляторами транскрипции. CoAA функционирует как транскрипционный коактиватор, регулирующий транскрипцию, опосредованную , и альтернативный сплайсинг. WTX — корегулятор транскрипции и супрессор опухолей, он коактивирует транскрипцию белка WT1, который также может локализоваться в параспеклах. SOX9 — это транскрипционный фактор, играющий важнейшую роль в формировании костей. Он непосредственно взаимодействует с P54NRB, а его сверхэкспрессия приводит к изменению локализации P54NRB и PSPC1. BCL11A является транскрипционным фактором, который вовлечён в развитие /лейкемий. Фактор разрезания CFIM68 необходим для первого этапа процессинга 3'-конца пре-мРНК.
Для формирования параспекл строго необходимы белки NONO и SFPQ. Кроме того, нокдаун таких белков, как HNRNPK, DAZAP1, FUS, RBM14 и HNRNPH3 приводит к отсутствию параспекл.
РНК До описания конкретных РНК, входящих в параспеклы, был известен ряд свидетельств того, что параспеклы действительно содержат РНК помимо белков. Во-первых, параспеклы разрушаются при обработке клеток РНКазой. Во-вторых, во всех важнейших белках параспеклах содержатся мотивы, связывающие РНК, кроме того, все эти белки так или иначе участвуют в процессинге РНК. В-третьих, для локализации PSPC1 в параспеклах необходим РНК-связывающий домен этого белка. Наконец, параспеклы исчезают при подавлении транскрипции, опосредованной РНК-полимеразой II, и снова появляются при возобновлении транскрипции. Известны две РНК, входящие в состав параспекл: Ctn и NEAT1/Men ε/β.
Ctn стала первой открытой РНК параспекл, она была описана в 2005 году. Это специфичный для мышей транскрипт с поли(А)-хвостом, который считывается с локуса mCAT2. В состав Ctn входят все экзоны белка-транспортера CAT2, однако, в отличие от мРНК этого белка, Ctn синтезируется с другого промотора и имеет более длинную 3'-нетранслируемую область (3'-НТО). Ctn локализуется не только в параспеклах, но и в нуклеоплазме. 3'-НТО этой РНК подвергается интенсивному редактированию А → I, причём редактируются инвертированные повторы, благодаря которым в структуре РНК образуются двуцепочечные участки. С инозином в РНК связывается белок параспекл P54NRB, который, кроме того, связывается с Ctn in vivo. Вероятно, благодаря связыванию с белками параспекл Ctn остаётся в параспеклах, а не экспортируется в цитоплазму. Под действием ряда стрессовых сигналов 3'-НТО Ctn разрезается, и количество этой РНК в ядре падает.
В 2009 году несколько групп исследователей независимо открыли вторую РНК параспекл — NEAT1. Эта длинная некодирующая РНК необходима для формирования и поддержания структурной целостности параспекл. Известно два варианта NEAT1, различающихся своей длиной; структурную роль в параспеклах играет длинная изоформа. Интересно, что длинная изоформа NEAT1 подвергается разрезанию очень близко к 3'-концу, из-за чего образуется очень короткая молекула РНК, похожая на тРНК. Нокдаун NEAT1 приводит к полной утрате параспекл, а сверхэкспрессия этой РНК приводит к увеличению количества параспекл в некоторых . Кроме того, параспеклы формируются вблизи генов NEAT1. По-видимому, как и в случае Ctn, локализация NEAT1 в параспеклах связана с взаимодействием с белками семейства DBHS, хотя NEAT1 не подвергается редактированию А → I. По изменению количества NEAT1 в клетке можно судить о функционировании параспекл. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, а также индуцированные плюрипотентные стволовые клетки не экспрессируют NEAT1 и не имеют параспекл, несмотря на экспрессию белков DBHS, однако при начале дифференцировки параспеклы появляются. Кроме того, с появлением параспекл усиливается накопление в ядре мРНК, подвергшихся редактированию А → I.
Формирование Согласно существующей модели, формирование параспекл начинается с образования транскриптов NEAT1 в ядрах дочерних клеток вскоре после клеточного деления. Вскоре после синтеза молекулы NEAT1 формируют комплексы с белками DBHS, причём транскрипты NEAT1 не успевают удалиться от своего локуса. Сформированные параспеклы, вероятнее всего, состоят из множества комплексов NEAT1 с белками DBHS и довольно динамичны: отдельные молекулы белков DBHS могут уходить в нуклеоплазму и обратно. Вероятно, в формировании параспекл задействована способность белков DBHS к олигомеризации, а также взаимодействия непосредственно между самими молекулами РНК NEAT1. В отсутствие NEAT1 параспеклы неспособны поддерживать свою структурную целостность и не формируются заново. Согласно последним данным, в формировании параспекл задействовано разделение фаз на границе жидкость—жидкость (). Капельки с разделенными фазами образуются благодаря поликомб белку ASXL1, который кроме того, усиливает экспрессию NEAT1 и увеличивает взаимодействия NONO-NEAT1Yamamoto, K., Goyama, S., Asada, S., Fujino, T., Yonezawa, T., Sato, N., ... & Kitamura, T. (2021). A histone modifier, ASXL1, interacts with NONO and is involved in paraspeckle formation in hematopoietic cells . Cell Reports, 36(8), 109576.
Функции