thumb|300px|Znázornenie Cvetovho pokusu. 1 – extrakt rastlinných farbív v petroléteri; 2 – čistý petroléter; 3 – stacionárna fáza (uhličitan vápenatý); 4 – sklená kolóna; A, B, C – zložky separovanej zmesi
Chromatografia je fyzikálno-chemická separačná metóda. Názov je odvodený z gréčtiny: chroma = farba, graphein = písať). Jej podstatou je rozdeľovanie zložiek zmesi medzi dvoma fázami: stacionárnou fázou (nepohyblivou) a mobilnou fázou (pohyblivou). Separácia zložiek zmesi je dôsledkom rozdielnej afinity jednotlivých zložiek ku týmto dvom fázam.Stacionárna fáza má schopnosť pútať na svojom povrchu (adsorbovať) delené látky rozpustené v mobilnej fáze rôznymi nekovalentnými interakciami (van der Waalsove sily, elektrostatické interakcie monopólov, dipólov a kvadrupólov, vodíkové väzby). Ak je vo vzorke nanášanej na kolónu viac látok (ide o homogénnu zmes látok, i.e. roztok), ktoré majú rôznu afinitu ku stacionárnej a mobilnej fáze, putujú jednotlivé látky zmesi rozličnou rýchlosťou, čím dochádza ku ich vzájomnému rozdeľovaniu. náhľad|359x359bod|Schéma kvapalinovej chromatografie (LC, liquid chromatography) na chromatografickej kolóne naplnenej stacionárnou fázou. Vľavo: na povrch kolóny sa opatrne nanesie vzorka obsahujúca zmes látok (zmes krížikov a trojuholníkov) vo forme homogénnej zmesi (roztoku). Druhý vľavo: na kolónu sa privádza mobilná fáza (kvapalné rozpúšťadlo alebo zmes rozpúšťadiel), zmes látok sa začne pohybovať v kolóne v smere toku mobilnej fázy. Stredný obrázok: vplyvom absorpcie chemických látok (krížikov a trojuholníkov) na stacionárnu fázu, dochádza ku spomaľovaniu pohybu látky, ktorá má vyššiu afinitu ku stacionárnej fáze (krížiky). Látka s nižšou afinitou k stacionárnej fáze (trojuholníky) sa pohybuje v kolóne rýchlejšie a teda je nižšie – ďalej od štartu, kde bola nanesená). Druhý obrázok sprava: jednotlivé látky na kolóne sa od seba vzďaľujú, teda budú čistejšie. Obrázok napravo: Rýchlejšie pohybujúca sa látka (trojuholníky, látka s nižšou afinitou k stacionárnej fáze) vytiekla z kolóny do pripravenej banky/skúmavky. Ide o čistú látku rozpustenú v mobilnej fáze. Chromatografia postupuje ďalej (pridávaním ďalšieho elučného činidla (mobilnej fázy)), kým vytečie posledná látka (najpomalšie sa pohybujúca na kolóne: krížiky), ktorá bude zachytená do osobitnej banky/skúmavky. Po skončení chomatografie kolónu premývame polárnym rozpúšťadlom, u silikagélu najčastejšie metanolom, resp. destilovanou/deionizovanou vodou. Následne vykonáme prefúknutie kolóny vzduchom (air purge) na odtránenie kvapaliny z kolóny a použitú stacionárnu fázu (silikagél) vyhodíme do osobitnej nádoby na použitý silikagél. Získané roztoky separovaných látok (roztok trojuholníkov a roztok krížikov) analyzujeme pomocou TLC alebo NMR. Tieto roztoky následne destilujeme na rotačnej vákuovej odparke za zisku čistých pevných látok, ktoré presušíme na hlbokom vákuu cez noc (na vákuovej olejovej pumpe), nakoniec látky charakterizujeme pomocou NMR a HRMS. Stacionárna a mobilná fáza sa od seba odlišujú niektorou základnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami, napr. polaritou a skupenstvom, t. j. ku stacionárnej fáze v pevnom skupenstve (silikagél, alumina: oxid hlinitý, mikrokryštalická celulóza, amylóza) volíme kvapalnú mobilnú fázu (čisté rozpúšťadlo, resp. zmes dvoch alebo viacerých rozpúšťadiel). Z hľadiska polarity delíme stacionárne fázy na polárne stacionárne fázy (silikagél, i.e. hydratovaný oxid kremičitý, alumina, i.e. hydratovaný oxid hlinitý) a nepolárne stacionárne fázy (C18-silikagél).
Z hľadiska polarity delíme mobilné fázy na polárne mobilné fázy (typicky voda, metanol, etanol, acetonitril). Mobilné fázy používané v chromatografii sa členia podľa polarity pomocou makroskopickej veličiny: relatívnej permitivity a s ňou súvisiacou relatívnou dielektrickou konštantou εr: εr (voda) = 80; εr (benzén) = 2,3. Rozpúšťadlá používané v chromatografii sa delenia podľa vzrastajúcej sily, ktorou vytesňujú organické látky zo stacionárnej fázy silikagélu (sila eluentu ε0) do eluotropického radu (mixotropný rad): pentán < hexán < heptán < benzén < toluén < chloroform < dichlórmetán < acetón < dioxán < etylacetát < pyridín < etanol <metanol < voda. Zovšeobecnený eluotropický rad: popusuje skupiny organických látok (rozpúšťadiel) podľa vzrastajúcej sily, ktorou vytesňujú organické látky zo stacionárnej fázy silikagélu: alifatické uhľovodíky (pentán, hexán, zmes hexánov, heptán) < alicyklické uhľovodíky (cykloxexán, cyklopentán) < aromatické uhľovodíky (benzén, toluén, chlórbenzén) < chlórované uhľovodíky (chloroform, dichlórmetán, tetrachlórmetán) < étery a estery (dietyléter, etylacetát, metyltercbutyléter, dioxán) < nitrily (acetonitril) < ketóny (acetón) < alkoholy (izopropanol, etanol, metanol) < voda < vodné roztoky solí a pufre. +Eluotropický rad niektorých bežných rozpúšťadiel na hydrofilnej stacionárnej fáze (silikagél/alumina)RozpúšťadloSkratkaSila eluentu ε0Ultrafialová hranica detekcie (nm)pentánPen0.00190hexánHex0.01195heptánHep0.01200trichlórtrifluóretán0.02231cyklohexánCyHex0.04cyklopentánCyPen0.05sulfid uhličitý0.15tetrachlórmetán0.18xylénXy0.26diizopropyléteriPr2O0.28toluénPhMe0.29284chlórbenzénPhCl0.30benzénPhH0.32dietyléterEt2O0.38215chloroform0.40dichlórmetánDCM0.422331,2-dichlóretánDCE0.44metyltercbutyléter0.48210bután-2-ónMeCOEt0.51trietylamínEt3N/TEA0.54acetón0.56330dioxándiox0.56215tetrahydrofuránTHF0.57212etylacetátEtOAc0.58256dietylamínDEA0.63nitrometánMeNO20.64acetonitrilAcCN0.65190pyridínPy0.71dimetylsulfoxidDMSO0.75propanolPrOH0.82izopropanoli-PrOH0.82205etanolEtOH0.88metanolMeOH0.95205etylénglykol (etán-1,2-diol)1.11kyselina octováAcOHvysoký (≥ 1)vodaWvyššípufre/vodné roztoky solíbuffnajvyšší
História chromatografie Objaviteľom chromatografie je ruský botanik M. S. Cvet. V roku 1901 sa pokúsil rozdeliť petroléterový extrakt rastlinných farbív – chlorofylov a karotenoidov. Uskutočnil to pomocou stĺpcovej adsorpčnej chromatografie. Ako stacionárnu fázu (adsorbent) použil čistý, jemne mletý uhličitan vápenatý (CaCO3). Mobilnou fázou bol už spomenutý petroléter.
Cvet najprv zhotovil sklenú kolónu, ktorú naplnil adsorbentom. Na čelo tejto kolóny postupne privádzal extrakt farbív (vzorku) a súčasne privádzal aj čistý petroléter. Po určitom čase sa jednotlivé zložky v kolóne oddelili a ďalším premývaním boli postupne eluované (opúšťali kolónu). Cvet takto získal oddelené petroléterové roztoky všetkých farbív (eluáty), ktoré boli predtým v zmesi.
Rozdelenie chromatografických techník Chromatografické metódy sa dajú klasifikovať z rôznych hľadísk:
Z hľadiska skupenstva fáz plynová chromatografia (GC, gas chromatography) pracuje v systéme plyn-pevná látka alebo plyn-kvapalina. kvapalinová chromatografia (LC, liquid chromatography) pracuje v systéme kvapalina-kvapalina alebo kvapalina-pevná látka. +Prehľad chromatografických metódMobilná fázaSeparačný mechanizmusMetódaSkratka metódyplynadsorpciaplynová adsorpčná chromatografiarozdeľovanieplynová rozdeľovacia chromatografiaGLCsieťový efektplynová chromatografia na molekulových sitáchGSCkvapalinaadsorpciakvapalinová adsorpčná chromatografiaLSCrozdeľovaniekvapalinová rozdeľovacia chromatografiaLLCsieťový efektgélová permeačná chromatografiaGPCchemisorpciaiónová výmenná chromatografiaIECšpecifická interakcia biomolekúlafinitná chromatografia
Z hľadiska mechanizmu separácie Delenie chromatografických metód podľa separačného mechanizmu je založené na charaktere interakcie delenej látky so stacionárnou fázou: adsorpčná chromatografia – látky sa delia na základe rôznej adsorpcie na stacionárnu fázu, ktorá závisí od zvolenej mobilnej a stacionárnej fázy. Adsorpcia látok je dôsledkom polárnch síl pôsobiacich medzi povrchom adsorbentu a separovanou látkou a polárnych síl, pôsobiacich medzi povrchom adsorbentu a mobilnou fázou. O jedno väzobné miesto na povrchu adsorbentu teda medzi sebou bojujú molekuly separovanej látky a molekuly rozpúšťadla (mobilnej fázy). Adsorpčná chromatografia sa používa v organickej chémii na získanie produktu chemickej reakcie z komplikovaných reakčných zmesí, ktoré obsahujú nezreagované reaktanty, činidlá, katalyzátory a vedľajšie produkty. rozdeľovacia chromatografia – je založená na rozdeľovaní látok v systéme dvoch vzájomne nemiešateľných kvapalín, z ktorých jedna kvapalina je zakotvená na inertnom pevnom nosiči (stacionárna kvapalná fáza) a druhá kvapalná fáza preteká (mobilná kvapalná fáza). Rôzne látky sa delia na základe ich rozdeľovacej konštanty K, ktorá je charakteristická pre každú látku a závisí od voľby kvapalných fáz. ionexová chromatografia – (nazývaná tiež chromatografia na meničoch iónov) stacionárnu fázu tvorí ionex (menič iónov) s nabitými funkčnými skupinami. Analyt obsahuje látky nabité opačným nábojom. Ak má stacionárna fáza záporne nabité funkčné skupiny (kyslé skupiny ako -SO3H, -CO2H), hovoríme o katiónovom iónomeniči (katexe), pretože vymieňa katióny. Ak má stacionárna fáza kladne nabité funkčné skupiny (bázické skupiny ako terciárne amíny -NR2 alebo kvartérne amóniové soli -NR3+, hovoríme o aniónovom iónomeniči (anexe), pretože vymieňa anióny. Ionexová chromatografia sa používa v biochémii (nukleotidy, nukleoziddifosfáty, nukleozidtrifosfáty, oligonukleotidy) a organickej chémii na separáciu elektricky nabitých produktov (amóniové soli, organické kyseliny, organické soli) z komplikovaných reakčných zmesí, ktoré obsahujú nezreagované reaktanty, činidlá, katalyzátory a vedľajšie produkty. Na úvod ionexovej chromatografie je potrebné katex previezť do tzv. H+-formy, resp. anex do OH--formy. Následne naniesť vzorku na ionex a eluovať vodou, resp. vhodným pufrom. V priebehu chromatografie sa na ionexe zachytí žiadaný produkt elektrostatickými interakciami (katiónový produkt sa zachytáva na katexe, aniónový produkt sa zachytáva na anexe). Látky z reakčnej zmesi, ktoré nemajú charakter soli (nie sú tvorené katiónmi a aniónmi), pretečú kolónou bez zachytenia na stacionárnej fáze ionexu. Žiadaný produkt je následne nutné uvoľniť z ionexu. To sa realizuje premývaním ionexu: katex sa premýva zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, čím sa uvoľní žiadaný organický katión (ktorý sa uvoľní vo forme chloridovej soli) z ionexu (ktorý prejde do H+-formy). Anex sa premýva tiež zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, čím sa uvoľní žiadaný organický anión (ktorý sa uvoľní v protonizovanej forme: vo forme kyseliny) z ionexu (ktorý prejde do Cl--formy). Anex je vhodné skladovať v Cl--forme, v prípade potreby je možné previezť z Cl--formy do OH--formy roztokom hydroxidu sodného. Anex nie je vhodné skladovať v OH--forme, pretože pri dlhodobom státí sa v tejto forme anex degraduje. Je nutné dávať pozor, aby ionex "nepodtiekol" – aby hladina mobilnej fázy nepoklesla po výšku ionexu v kolóne – v takomto prípade sa ionex zhehodnotí tým, že nabobtnný polymér popraská a zničia sa jednotlivé zrniečka ionexu. gélová chromatografia – stacionárnu fázu tvorí pórovitý gél, používa sa v biochémii na separáciu proteínov pokrytých tenzidom SDS, nukleových kyselín naštiepených restrikčnými nukleázami. afinitná chromatografia – využíva látky vyskytujúce sa v prírode, na ktoré sa špecificky viažu určité molekuly, na stacionárnu fázu sú často naviazané protilátky a v mobilnej fáze sú rozpustené antigény. chirálna chromatografia – využíva chirálnu látku (jeden enantiomér, resp. diastereoizomér) ako stacionárnu fázu (napríklad amylózu), umožňuje od seba odseparovať enantioméry, resp. diastereoizoméry líšiace na jednom chirálnom centre (epiméry): v eluáte potom zachytávame a charakterizujeme (nepriamymi metódami ako cirkulárny dichroizmus) rýchlo eluujúci epimér (FEE: fast eluting epimer - má nižšiu afinitu ku stacionárnej fáze, vyjde z kolóny skôr, má nižší elučný objem) a pomaly eluujúci epimér (SEE: slow eluting epimer - má vyššiu afinitu ku stacionárnej fáze, vyjde z kolóny neskôr, má vyšší elučný objem). Ide o tak zvanú chirálnu rezolúciu epimérov, resp. enantiomérov.