Визначення груп крові — лабораторне дослідження з метою встановити антигенну структуру еритроцитів крові конкретної людини. Найчастіше проводиться визначення групи крові по системі АВО та резус-фактор, що має клінічне значення при переливанні крові (гемотрансфузії) в медицині.Наказ Міністерства охорони здоров'я України 05.07.1999 N 164 ІНСТРУКЦІЯ з визначення груп крові за системою AB0
Групи крові у людини — це система антигенів еритроцитів, яка представлена олігосахаридними структурами, зв'язаними з білками оболонки еритроцитів, котрі здатні викликати утворення специфічних антитіл і вступати з ними в реакцію. Антигенна структура еритроцитів (фенотип) є генетично визначеною (генотип). Характерною властивістю групових антигенів є їх здатність до стимуляції продукції відповідних до них антитіл у людей, які не мають цього антигену. В трансфузіологічній серології відрізняються два типи групових антитіл: природні та імунні. Відомо більше 20 систем еритроцитарних антигенів. Однак практичне значення мають система AB0 та система Rh, оскільки вони найчастіше є причиною важких посттрансфузійних ускладнень, і їх необхідно, в першу чергу, враховувати при гемотрансфузіях.
Визначення груп крові за системою AB0
Визначення груп крові за системою AB0 ґрунтується на феномені аглютинації з використанням двох методичних підходів:
1.На еритроцитах визначають наявність антигенів A, B за допомогою: стандартних сироваток із специфічними ізоаглютинінами моноклональних антитіл (МКА), також використовується назва цоліклони
2.У сироватці визначають наявність ізоаглютинінів α(альфа) та β(бета) за допомогою стандартних еритроцитів відомої групи крові.
Визначення групи крові у людей проводять лікарі-лаборанти спеціалізованих і відповідно сертифікованих лабораторій. При надходженні на стаціонарне лікування, первинне визначення групи крові виконують спеціально підготовлені лікарі-лаборанти централізованих (клінічних) лабораторій. У невідкладних випадках, коли хворому необхідна термінова трансфузія компонентів крові, а визначення групи крові лікарем-лаборантом неможливо організувати, визначення групи крові проводить лікуючий лікар з обов'язковим наступним наданням пробірки з кров'ю хворого в лабораторію для остаточного визначення групової належності.
Реагенти та обладнання Стандартні сироватки груп 0(I), A(II), B(III). Стандартні сироватки груп 0(I), A(II), B(III) двох різних серій кожної групи і стандартна сироватка групи AB(IV). Стандартні сироватки для визначення груп крові виготовляють спеціальні лабораторії при установах служби крові. Сироватки зберігають у холодильнику при температурі + 6 (+/- 2) град. C. Термін зберігання сироватки вказаний на етикетці. Стандартні еритроцити підгруп 0(I), A(II), B(III). Стандартні еритроцити готують із крові донорів. Стандартні еритроцити зберігають у холодильнику при температурі + 6 (+/- 2) град. C. Термін зберігання — до 3 діб. Стандартні тест-еритроцити можна одержати в готовому вигляді в закладах служби крові, які виготовляють ці стандарти. Моноклональні антитіла анти-A, анти-B, анти-AB. Ізотонічний (0,9 %) розчин натрію хлориду. Білі порцелянові або інші пластини, предметні скельця з змочуваною поверхнею. 3,8 % — 5 % розчин натрію цитрату, гепарин, консервант крові. Пробірки. Піпетки. Скляні палички. Вата гігроскопічна.
Техніка визначення груп крові за допомогою стандартних сироваток Визначення проводять у приміщенні з задовільним освітленням при температурі від +15 до +25 град. C. Використовують цільну кров, відмиті еритроцити, еритроцити в плазмі, сироватці або в 0,9 % розчині натрію хлориду. У хворих на анемію кров стабілізують гепарином.
Позначити на площині групу крові зліва направо «0», «A», «B». Під відповідними позначками нанести по одній великій краплі (0,1 мл) кожної сироватки двох серій. Поряд з кожною сироваткою нанести по 1 маленькій краплі (0,01 мл) досліджуваної крові (еритроцитів). Змішати окремими скляними паличками кожну краплю крові (еритроцитів) з відповідною сироваткою. Змішавши всі краплі, пластину погойдують, потім на 1-2 хв. залишають у спокої і знову погойдують. Спостереження за ходом реакції проводять не менше як 5 хв., хоча аглютинація починається вже протягом перших 10-30 с. Спостереження необхідно продовжувати далі — до 5 хв., тому що можлива пізня аглютинація, наприклад, з еритроцитами групи A2. Через 3-4 хв. до крапель суміші сироватки з еритроцитами, де відбулась аглютинація, додають по 1 краплі (0,05 мл) 0,9 % розчину натрію хлориду і продовжують спостерігати до 5 хв. при періодичному погойдуванні пластини.
Трактування результатів реакції під час визначення груп крові за допомогою стандартних сироваток
Реакція ізогемаглютинації в кожній краплі може бути позитивною і негативною. У разі позитивної реакції (звичайно протягом перших 10-30 сек. від початку змішування) в суміші з'являються видимі неозброєним оком дрібні червоні зернятка (аглютинати), які складаються з склеєних еритроцитів. Дрібні зернятка поступово склеюються в більш великі зерна, а інколи — в пластівці неправильної форми, в результаті чого сироватка зовсім або частково знебарвлюється. У разі негативної реакції рідина весь час (5 хв.) залишається рівномірно забарвленою і в ній не спостерігається зернистості (аглютинатів). Результати реакції в краплях з сироватками однієї і тієї ж групи (двох серій) мають співпадати. Результати реакцій з сироватками трьох груп: 0(I), A(II) і B(III) можуть дати чотири різні комбінації. +Трактування результатів реакції при визначенні груп крові за допомогою алоімунних стандартних групоспецифічних сироватокРезультати реакції з сироваткамиДосліджувана кров належить до групи0(I)A(II)B(III)0(I)A(II)B(III)AB (IV)Реакції немаєРеакція аглютинації позитивна
Техніка визначення групи крові перехресним методом (за допомогою стандартних сироваток і стандартних еритроцитів) Визначення групи крові перехресним методом базується на паралельному визначенні наявності або відсутності групових антигенів на еритроцитах і наявності або відсутності групових ізоаглютинінів у сироватці обстежуваної крові. Паралельне визначення ізоаглютинінів у сироватці з стандартними еритроцитами A та B обов'язкове у донорів і реципієнтів.
Для визначення групи крові використовують стандартні сироватки груп 0 α(альфа)β(бета)(I), A β(бета)(II) і B α(альфа)(III) двох серій кожної групи, сироватку групи AB(IV) і стандартні еритроцити груп 0(I), A(II) і B(III).
Під відповідними позначками груп крові на пластинку наносять по одній великій краплі (0,1 мл) стандартних сироваток груп 0(I), A(II) і B(III) послідовно зліва направо. На нижню частину пластинки (третій ряд) під відповідними написами наносять по одній маленькій (0,01 мл) краплі стандартних еритроцитів у такій послідовності зліва направо: 0(I), A(II) і B(III)
+Схема розташування реагентів на площині під час визначення групи крові за системою AB0 перехресним методомРеагенти, що наносять на площину0 α(альфа)β(бета)(I)A β(бета)(II)B α(альфа)(III)1Стандартна алоімунна сироватка, серія 1α(альфа)β(бета)β(бета)α(альфа)2Стандартна алоімунна сироватка, серія 2α(альфа)β(бета)β(бета)α(альфа)3Стандартні еритроцити0AB
З пробірки, що містить кров хворого, піпеткою знімають сироватку і наносять її по одній великій краплі (0,1 мл) на підготовлені стандартні еритроцити (третій ряд). Після цього тією ж піпеткою набирають з дна пробірки еритроцити обстежуваної крові і наносять їх по маленькій краплі (0,01 мл) в 6 точок (другий і перший ряд) — по одній краплі поряд з кожною краплею підготовленої стандартної сироватки. У всіх краплях сироватку старанно перемішують з еритроцитами сухою скляною паличкою, ретельно промиваючи її 0,9 % розчином натрію хлориду і витираючи ватою після кожного перемішування. Пластинку періодично погойдують, проводячи спостереження за ходом реакції протягом 5 хв. У процесі аглютинації, але не раніше ніж через 3 хв., в ті краплі, в яких вона з'явилася, додають по одній краплі (0,05 мл) 0,9 % розчину натрію хлориду і продовжують спостереження при погойдуванні пластинки до 5 хв.
Трактування результатів при визначенні груп крові перехресним методом Трактування результатів реакцій проводять за оцінкою і співставленням результатів, отриманих за допомогою стандартних сироваток (два верхні ряди) і за допомогою стандартних еритроцитів (нижній ряд). Результати реакцій, отриманих за допомогою стандартних сироваток і стандартних еритроцитів, повинні співпадати, тобто вказувати на наявність аглютиногенів та аглютинінів відповідно до однієї й тієї ж групи крові. Можливі чотири комбінації результатів. +Трактування результатів реакцій визначення груп крові перехресним методомВизначення групи за системою AB0 за допомогою стандартних сироватокВизначення ізоаглютинінів за допомогою стандартних еритроцитівГрупа крові та ізоаглютиніниα(альфа)β(бета)β(бета)α(альфа)0AB0 α(альфа)β(бета)А β(бета)В α(альфа)АВ немаєРеакції немаєРеакція аглютинації позитивна Примітка. При встановленні групи крові AB(IV) необхідно провести контрольне дослідження цих еритроцитів з сироваткою групи AB(IV). Підтвердженням належності до цієї групи є відсутність аглютинації.
Застосування моноклональних антитіл (МКА, цоліклонів) анти-A та анти-B для визначення груп крові за системою AB0 Моноклональні антитіла анти-A та анти-B призначені для визначення груп крові людини за системою AB0 замість стандартних ізогемаглютинуючих сироваток. Визначення груп крові за системою AB0 у донорів і реципієнтів перехресним методом включає виявлення антигенів A і B в еритроцитах людини за допомогою МКА анти-A та анти-B, виявлення ізоаглютинінів α(альфа) і β(бета) у сироватці або плазмі досліджуваної крові стандартними тест-еритроцитами всіх груп.
Переваги використання моноклональних антитіл Моноклональні антитіла анти-A та анти-B перевірені всіма поширеними методами визначення груп крові — паралельно з ізогемаглютинуючими сироватками AB0. Результати довели надійність визначення груп крові у разі застосування моноклональних реагентів. Авідність, тобто час настання реакції аглютинації, її яскравість, у МКА анти-A та анти-B набагато вища, ніж у стандартних сироваток, особливо у випадку слабко виражених антигенів еритроцитів.
Техніка визначення груп крові за системою AB0 за допомогою моноклональних антитіл (МКА) Визначення груп крові за системою AB0 проводиться в крові, як стабілізованій за допомогою консервантів так і в крові без консерванту. Визначення групи крові проводять у приміщенні з добрим освітленням при температурі від +15 до +25 град. C. Визначення групи крові за системою AB0 реагентами МКА проводять звичайними методами виявлення антигенів еритроцитів під час масового визначення в установах служби крові — на планшетах або автоматичних системах, у разі індивідуального визначення — на білій порцеляновій або будь-якій іншій пластинці зі змочуваною поверхнею.
Беручи до уваги високу активність і авідність реагентів МКА, а також повну їх стандартність, для кожного визначення групи крові (крім випадку, коли група крові визначається вперше) достатньо застосовувати по одній серії реагентів анти-A і анти-B. У такому випадку необхідно використовувати МКА анти-AB, оскільки цей реагент служить додатковим контролем. Якщо реагенту анти-AB немає, слід проводити визначення двома серіями МКА анти-A і анти-B.
на планшет або пластинку моноклональних антитіл анти-А і анти-В наносять по одній великій краплі (0,1 мл) під відповідними написами: «анти-A» або «анти-B». Поряд з краплями антитіл наносять досліджувану кров по одній маленькій краплі, приблизно в 10 разів меншій від краплі антитіл (0,01 мл). антитіла і кров змішують ретельно вимитою сухою кулькою, погойдуючи планшет; у разі визначення на пластинці — скляною паличкою, яку промивають і насухо витирають після розмішування кожної краплі. спостереження за перебігом реакцій з МКА проводять за легкого погойдування пластинки чи планшета не більше 3 хв. Результат реакції в кожній краплі може бути позитивним або негативним.