Метаболічні кінази — група ферментів змінюючих форму шляхом індукованого припасування при зв'язуванні субстрату, утворюючи фермент-субстратний комплекс. Ферменти повинні зв'язувати свої субстрати, перш ніж вони зможуть каталізувати будь-яку хімічну реакцію. Ферменти зазвичай дуже конкретні щодо того, з якими субстратами вони зв'язуються, а потім каталізується хімічна реакція.
Фосфогліцерат-кіназа 1 (PGK-1) Основна стаття: Фосфогліцераткіназа-1. Фосфогліцерат-кіназа 1 (EC 2.7.2.3) (PGK-1) — це фермент, що відноситься до класу трансфераз. Один з двох ізоферментів PGK в організмі людини. Каталізує оборотний перенос фосфатної групи з 1,3-бісфосфогліцерату (1,3-BFG) на аденозиндифосфат (АДФ) з утворенням 3-фосфогліцерату (3-PG) та аденозинтрифосфату (АТФ). Внаслідок оборотності процесу, грає роль як в гліколізі, так і в глюкогенезі.
На додаток до своєї ролі гліколітичного ферменту, доведено що PGK-1 діє як білок альфа-кофактор полімерази (білок розпізнавання праймерів).Jindal H.K., Vishwanatha J.K. (1990) «Functional identity of a primer recognition protein as phosphoglycerate kinase». J. Biol. Chem. 265:6540-6543 PMID 2324090
Показано, що при ракових захворюваннях може діяти як тіол-редуктаза, руйнуючи плазмін. Вивільнений в процесі ангіостатин інгібує ангіогенез (виникнення і ріст кровоносних судин) в пухлині, завдяки цьому сповільнюється її ріст і зменшується ризик виникнення метастаз.Lay AJ, Jiang XM, Kisker O, Flynn E, Underwood A, Condron R, Hogg PJ (December 2000). «Phosphoglycerate kinase acts in tumour angiogenesis as a disulphide reductase». Nature. 408 (6814): 869–73. doi:10.1038/35048596. PMID 11130727. S2CID 4340557.
Ізоферменти
У людини виявлено два ізоферменти PGK, PGK-1 та PGK-2. Ізоферменти мають 87-88 % ідентичності амінокислотної послідовності, PGK-1, кодований на X -хромосомі, експресується у всіх клітинах, на відміну від свого ізоферменту PGK-2 унікального для мейотичних та постмейотичних сперматогенних клітин.Chiarelli LR, Morera SM, Bianchi P, Fermo E, Zanella A, Galizzi A, Valentini G (2012). «Molecular insights on pathogenic effects of mutations causing phosphoglycerate kinase deficiency». PLOS ONE. 7 (2): e32065. doi:10.1371/journal.pone.0032065. PMC 3279470. PMID 22348148.
Структура
PGK еукаріот є вкрай консервативним в процесі єволюції,Blake, C.C.F., and Evans, P.R. (1974) J. Mol. Biol., 84, 585—601. існує у вигляді мономера (415 ланок) білобальної структури, що складається з двох доменів, які відповідають N- і C-кінцю білка. Два домени розділені щілиною та з'єднані 2 альфа спіралями. Кожен домен складається з 6-ланцюгового бета-шару, оточеного альфа-спіралямиWatson HC, Walker NP, Shaw PJ, Bryant TN, Wendell PL, Fothergill LA, Perkins RE, Conroy SC, Dobson MJ, Tuite MF (1982). «Sequence and structure of yeast phosphoglycerate kinase». The EMBO Journal. 1 (12): 1635–40. doi:10.1002/j.1460-2075.1982.tb01366.x. PMC 553262. PMID 6765200 3-фосфогліцерат (3-PG) зв'язується з N-кінцем, тоді як нуклеотидні субстрати, Mg-ATP або Mg-ADP, зв'язуються з C-кінцем ферменту. Відкрита конформація PGK є більш стабільною завдяки впливу гідрофобної області білка при закритті доменуYon JM, Desmadril M, Betton JM, Minard P, Ballery N, Missiakas D, Gaillard-Miran S, Perahia D, Mouawad L (1990). «Flexibility and folding of phosphoglycerate kinase». Biochimie. 72 (6–7): 417–29. doi:10.1016/0300-9084(90)90066-p. PMID 2124145.
Механізм дії
Без впливу зовнішніх факторів молекула ензиму існує в розгорнутій формі. Згортання не починається без зв'язування обох субстратів (Mg-АДФ та 3-PG)Dhar A, Samiotakis A, Ebbinghaus S, Nienhaus L, Homouz D, Gruebele M, Cheung MS (October 2010). «Structure, function, and folding of phosphoglycerate kinase are strongly perturbed by macromolecular crowding». Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41): 17586–91. doi:10.1073/pnas.1006760107. PMC 2955104. PMID 20921368.. Відомо, що за відсутності магнію ферментативна активність PGK-1 відсутняCliff MJ, Bowler MW, Varga A, Marston JP, Szabó J, Hounslow AM, Baxter NJ, Blackburn GM, Vas M, Waltho JP (May 2010). «Transition state analogue structures of human phosphoglycerate kinase establish the importance of charge balance in catalysis». Journal of the American Chemical Society. 132 (18): 6507–16. doi:10.1021/ja100974t. PMID 20397725.. Цей двовалентний метал нейтралізує подвійний негативний заряд фосфатної групи полегшуючи нуклеофільну атаку, така стабілізація є типовою для фосфотрансферазBanks, R. D.; Blake, C. C. F.; Evans, P. R.; Haser, R.; Rice, D. W.; Hardy, G. W.; Merrett, M.; Phillips, A. W. (28 June 1979). «Sequence, structure and activity of phosphoglycerate kinase: a possible hinge-bending enzyme». Nature. 279 (5716): 773—777. doi:10.1038/279773a0. PMID 450128. S2CID 4321999.. Після зв'язування треозного і нуклеотидного фрагменту з доменами ферменту відбуваються конформаційні зміни, «молекулярний шарнір» зближує C-кінець з N-кінцемKumar S, Ma B, Tsai CJ, Wolfson H, Nussinov R (1999). «Folding funnels and conformational transitions via hinge-bending motions». Cell Biochemistry and Biophysics. 31 (2): 141–64. doi:10.1007/BF02738169. PMID 10593256. S2CID 41924983. Рушійною силою зближення є ефект «молекулярного скупчення», що спрощує згортання під тиском об'єму оточуючих макромолекул. Більш енергетично вигідний закритий перехідний стан, в якому всі три атоми кисню фосфатної групи зв'язані на відміну від двох зв'язаних у відкритому стані веде до утворення закритої конформаціїBernstein BE, Hol WG (March 1998). «Crystal structures of substrates and products bound to the phosphoglycerate kinase active site reveal the catalytic mechanism». Biochemistry. 37 (13): 4429–36. doi:10.1021/bi9724117. PMID 9521762. При цьому проходить перенос фосфат іону за допомогою Lys219 з 3-BGP на АДФ з утворенням АТФ.
Хвороби
Відомо, що мутації в PGK-1, призводять до порушення клітинного дихання еритроцитів. Оскільки фосфогліцераткіназа-1 кодується на Х-хромосомі (аутосомно-рецесивний тип) то, як правило, мутації мають симптоматичні наслідки тільки у чоловіків, тоді як уражені жінки є переносниками мутацій гену, але не мають симптомівYoshida A, Tani K (1983). «Phosphoglycerate kinase abnormalities: functional, structural and genomic aspects». Biomedica Biochimica Acta. 42 (11–12): S263-7. PMID 6689547.
При аналізі виділених мутантних кіназ, було виділено дві групи:
Перша група (гемолітична анемія і невропатія): мутації впливають насамперед на амінокислоти, які відіграють головну роль у збереженні структури білка а також дестабілізують альфа-спіралі появою проліну. Це ускладнює набуття потрібної просторової структури та веде до сильного зменшення стабільності і невеликого зменшення каталітичної активності PGK-1, призводячи до гемолітичної анемії. Дестабілізовані ензими швидко деградують при підвищенні температури (лихоманка, фізичне навантаження), але у скелетних м'язах дестабілізовані мутантні варіанти оперативно замінюються, тому не спостерігаються випадки м'язової дисфункції (міопатії). У нервовій тканині швидкість заміни недостатня, тому додатково спостерігаються неврологічні розлади (зменшення синтезу 3-PG також має вплив на синтез нейромодуляторів)
Друга група (міопатія): мутації впливають на амінокислоти, які грають ключову роль в утворенні водневих зв'язків у сайтах зв'язування субстратів. Це призводить до значного падіння каталітичної активності ензиму але не сильно впливає на термостійкість. Тому у пацієнтів с цієї групи спостерігалися м'язові дисфункції, і майже не проявлялися анемії і неврологічні розлади.
Піруваткіназа м'язів (PKM-2) Піруваткіназа м'язів (EC:2.7.1.40) PKM-2 -гліколітичний фермент, який каталізує перенесення фосфорильної групи з фосфоенолпірувату (PEP) на АДФ, утворюючи АТФ. На додаток до гліколітичної дії впливає на трансляцію та транскрипцію у клітинах, особливо ракових. У вигляді тетрамеру виконує гліколітичну функцію, у вигляді мономеру є цитозольним тироїд-зв'язувальним протеїном CTHBPH Kato, T Fukuda, C Parkison, P McPhie, and S Y Cheng (1989) «Cytosolic thyroid hormone-binding protein is a monomer of pyruvate kinase» PNAS 86 (20) 7861-7865; https://doi.org/10.1073/pnas.86.20.7861
Ізоферменти Піруваткіназа в клітинах ссавців має чотири ізоформи: L, R, M1, M2 кодовані 2 різними генами: PKLR і PKM. Ізоферменти L і R генеруються з PKLR, М1 і М2 з гена РКМ шляхом диференціального сплайсингу РНК. Тип L є основним у печінці, R міститься в еритроцитах, M1 є основною формою в м'язах, серці та мозку, а M2 міститься в тканинах де відбувається диференціація, наприклад у ранніх тканинах плода, а також у більшості ракових клітин.Dombrauckas JD, Santarsiero BD, Mesecar AD (July 2005). «Structural basis for tumor pyruvate kinase M2 allosteric regulation and catalysis». Biochemistry. 44 (27): 9417–29. doi:10.1021/bi0474923. PMID 15996096.
Структура і механізм Може існувати як мономер і гомотетрамер. За відсутності D-фруктози 1,6-бісфосфату (FBP) мономерна форма зв'язує Т3 і не переходить в тетрамер, у присутності FBP мономер оборотно асоціюється, утворюючи гомотетрамер. Утворення тетрамеру індукує активність піруваткінази бо тетрамерна форма має високу спорідненість до субстрату і пов'язана з гліколітичним ферментним комплексом. Одночасно зв'язування з тироїдами інгібується. Зв'язування з певними онкопротеїнами, такими як онкопротеїн HPV-16 E7, може спричинити димеризацію, тому в пухлинах існує в майже неактивній димерній формі, така форма має меншу спорідненість до субстрату. FBP стимулює утворення тетрамерів з димерівHugh P. Morgan, Francis J. O'Reilly, Martin A. Wear, J. Robert O'Neill, Linda A. Fothergill-Gilmore, Ted Hupp, and Malcolm D. Walkinshaw «M2 pyruvate kinase provides a mechanism for nutrient sensing and regulation of cell proliferation» PNAS April 9, 2013 110 (15) 5881-5886; https://doi.org/10.1073/pnas.1217157110. Співвідношення між високоактивною тетрамерною формою та майже неактивною димерною формою визначає, чи вуглеці глюкози направляються до біосинтетичних процесів чи використовуються для виробництва гліколітичного АТФ. Алостеричним регулятором є фруктоза 1,6-бісфосфат (FBP), кофакторами ензиму слугують Mg2+ i K+, інгібітором слугує оксалат.
Хвороби РКМ-2 має експресуватися в тканинах плоду а не дорослого організму, де поступово замінюються трьома іншими ізоформами.Brinck U, Eigenbrodt E, Oehmke M, Mazurek S, Fischer G (1994). «L- and M2-pyruvate kinase expression in renal cell carcinomas and their metastases». Virchows Archiv. 424 (2): 177–85. doi:10.1007/BF00193498. PMID 8180780. S2CID 5550950 Але у ракових пухлинах експресія починається знову, сприяючи проліферації ракових клітин. Присутність цієї ізоформи настільки значна і специфічна, що її наявність у плазмі крові людини використовується як молекулярний маркер для діагностики різних видів раку. В пухлинах замість експресії РКМ-1 починається експресія РКМ-2Christofk HR, Vander Heiden MG, Harris MH, Ramanathan A, Gerszten RE, Wei R, Fleming MD, Schreiber SL, Cantley LC (March 2008). «The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth». Nature. 452 (7184): 230–3. Bibcode:2008Natur.452..230C. doi:10.1038/nature06734. PMID 18337823. S2CID 16111842, яка при взаємодії з онкопротеїнами (pp60v-src, HPV-16 E7, і A-Raf) переходить в димерну форму, яка не проявляє кіназної активності, вся доступна глюкоза йде на процеси біосинтезу і сприяє росту пухлини.. У пухлинних клітинах підвищена швидкість вироблення лактату в присутності кисню називається ефектом Варбурга. Генетична маніпуляція раковими клітинами, щоб вони продукували дорослий РКМ1 замість РКМ2, змінює ефект Варбурга і зменшує швидкість росту цих модифікованих ракових клітин.Le Mellay V, Houben R, Troppmair J, Hagemann C, Mazurek S, Frey U, Beigel J, Weber C, Benz R, Eigenbrodt E, Rapp UR (2002). «Regulation of glycolysis by Raf protein serine/threonine kinases». Advances in Enzyme Regulation. 42: 317–32. doi:10.1016/S0065-2571(01)00036-X. PMID 12123723