Сигнальний шлях Notch — висококонсервативна клітинна сигнальна система, присутня у більшості тварин. Ссавці мають чотири типи рецепторів Notch, які називаються NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 і NOTCH4. Notch є трансмембранним бітопічним (один раз пронизує мембрану) рецепторним білком. Це гетероолігомер, що складається з двох частин: великої позаклітинної частини, та меншої, яка має коротку позаклітинну ділянку, трансмембранну ділянку та невелику внутрішньоклітинну область. Обидві частини пов'язані кальцій-залежним нековалентним зв'язком.

Notch опосередкований сигналінг сприяє проліферації під час нейрогенезу, та відіграє важливу роль у регуляції ембріонального розвитку. При переході до етапу дифереціації нейронів цей сигналінг пригнічується білком Numb.

Порушення у цьому сигнальному шляху спостерігаються при багатьох видах раку, Т-клітинному гострому лімфобластному лейкозі (T-ALL), церебральній аутосомно-домінантній артеріопатії з підкірковими інфарктами та лейкоенцефалопатії (CADASIL), розсіяному склерозі, тетралогії Фалло та синдромі Алагіля. При інгібуванні Notch-сигналінгу також було показано пригнічення проліферації Т-клітин при Т-клітинній гострій лімфобластній лейкемії як на культурі клітин, так і в мишей.

Відкриття Історія відкриття та дослідження цього шляху почалася у 1914 році, коли Джон Декстер помітив появу виїмки (notch - англ.) на крилах плодової мушки Drosophila melanogaster. Алелі відповідного гена були ідентифіковані в 1917 році американським еволюційним біологом Томасом Хантом Морганом, а його молекулярний аналіз і секвенування були незалежно проведені в 1980-х роках Спіросом Артаванісом-Цаконасом і Майклом В. Янгом. Алелі двох генів C. elegans Notch були ідентифіковані на основі фенотипів розвитку lin-12 і glp-1, . Клонування та часткове секвенування lin-12 було описане Айвою Грінвальд.

Механізм

Білок Notch пронизує клітинну мембрану, більшою своєю частною знаходячись ззовні клітини, а меншою - всередині та з внутнішього боку мембрани. Білки-ліганди, що зв’язуються з позаклітинним доменом, індукують протеолітичне відрізання та вивільнення внутрішньоклітинного домену, який далі потрапляє до клітинного ядра та бере участь у модифікації експресії генів.

Цю модель роботи, що передбачає відщеплення внутрішньоклітинного сегмента, вперше запропоновано 1993 року на основі роботи, виконаної з Drosophila Notch і C. elegans lin-12 , та на підставі інформації про першу онкогенну мутацію, що вражає людський ген Notch. Переконливі докази цієї моделі були надані в 1998 році в результаті досліджень на дрозофілі in vivo Гері Струлем та в культурі клітин Рафаелем Копаном. І попри початкову критику даної моделі, вже до 2001 року було накопичено достатньо даних для того, аби вона вважалася незаперечною.

Рецептори Notch зазвичай активуються через прямий міжклітинний контакт, при якому трансмембранні білки одних клітин утворюють безпосередній контакт із notch-рецепторами інших клітин та виступають для них лігандами. Зв'язування через Notch дозволяє групам клітин організовуватися таким чином, що якщо одна клітина виявляє певну ознаку, вона може бути вимкнена в сусідніх клітинах через notch-сигнал. Впливаючи одна на одну, групи клітин що таким чином взаємодіють здатні формувати великі структури. Механізми латерального гальмування є ключовими для Notch-сигналінгу. Notch та lin-12 визначають шлях розвиток бінарних клітин, оскільки латеральне інгібування включає механізми зворотного зв’язку для посилення початкових відмінностей. Виявлено, що сімейство рецепторів Notch/Lin-12/Glp-1 бере участь у специфікації долі клітин під час розвитку дрозофіли та C. elegans.

Notch каскад передбачає залучення Notch-рецепторів, лігандів Notch, а також внутрішньоклітинних білків, що передають сигнал Notch до ядра клітини.

Внутрішньоклітинний домен Notch утворює комплекс із CBF1 і Mastermind для активації транскрипції цільових генів. Структура цього комплексу наразі є визначеною і описаною.

Синтез Notch і каскад передачі сигналу Дозрівання рецептора notch у комплексі Гольджі включає частковий протеоліз на його майбутній позаклітинній стороні . У результаті утворюється двосторонній білок, що складається з великого позаклітинного домену, з’єднаного з меншим трансмембранним і внутрішньоклітинним доменами. Зв'язування ліганду зумовлює ще два послідовних етапи протеолізу, в результаті якого внутрішньоклітинний домен звільняється і, при подальшому потраплянні до ядра, залучає інші ДНК-зв'язуючі білки та регулює експресію генів.

Notch і більшість його лігандів є трансмембранними білками, тому щоб відбулася передача сигналу, клітини, що експресують ліганди, зазвичай повинні бути поруч із клітиною, що експресує notch. Ліганди Notch також є бітопічними трансмембранними білками та належать до сімейства білків DSL (Delta/Serrate/LAG-2). У Drosophila melanogaster (плодової мушки) є два ліганди, названі Delta та Serrate, у ссавців - Delta-like (дельтаподібні) та Jagged (зубчасті). При цьому у ссавців існує кілька типів цих дельта-подібних і зубчастих лігандів, а також, можливо, низка інших лігандів, таких як F3/контактин.

У нематоди C. elegans є два гени, що кодують гомологічні білки: glp-1 і lin-12. Припускають, що деякі їх клітини можуть простягати відростки, що дозволяють передавати сигнали між клітинами, які знаходяться на відстані до чотирьох-п’яти клітинних діаметрів одна від одної.

Позаклітинний домен Notch складається в основному з невеликих багатих цистином мотивів, які називаються EGF-подібними повторами.

Notch 1, наприклад, має 36 таких повторів. Кожен EGF-подібний повтор складається приблизно з 40 амінокислот, і його структура визначається в основному шістьма консервативними залишками цистеїну, які утворюють три консервативні дисульфідні зв’язки. Кожен EGF-подібний повтор може бути модифікований О-зв'язаними гліканами у певних сайтах. Так, O-глюкоза може бути додана між першим і другим консервативними цистеїнами, а O-фукоза - між другим і третім. Цей процес вставки вуглеводів здійснюється поки що неідентифікованою O-глюкозилтрансферазою (за винятком Rumi) і GDP-фукозо Білок O-фукозилтрансферазою 1 (POFUT1), відповідно. Додавання O-фукози за допомогою POFUT1 є абсолютно необхідним, і без ферменту для додавання O-фукози рецептори Notch будуть нездатні правильно функціонувати. Поки що є не повністю зрозуміло, яким чином на функціональну активність впливає глікозилювання.

О-глюкоза білка Notch може бути подовжена до трисахариду з додаванням двох цукрів ксилози за допомогою ксилозилтрансфераз, а О-фукоза може бути подовжена до тетрасахариду шляхом послідовного додавання N-ацетилглюкозаміну (GlcNAc) за допомогою N-Ацетилглюкозамінілтрансферази під назвою Fringe, додавання галактози за допомогою галактозилтрансферази та додавання сіалової кислоти за допомогою сіалілтрансферази.

Складності додає також те, що у ссавців є три GlcNAc-трансферази Fringe, які поетично називані лунатичною бахромою, маніакальною бахромою та радикальною бахромою (fringe - бахрома, англ). Ці ензими відповідають за те, що називається «ефект бахроми» при передачі сигналів Notch. Якщо Fringe додає GlcNAc до O-фукозного цукру, то відбудеться подальше додавання галактози та сіалової кислоти. У присутності цього тетрасахариду notch з високою ефективністю передає сигнали, коли він взаємодіє з дельта-лігандом, але помітно пригнічує передачу сигналів при взаємодії з лігандом Jagged. Механізм, яким це додавання цукру пригнічує передачу сигналів через один ліганд, і потенціює передачу сигналів через інший, наразі не є чітко зрозумілими.

Як тільки позаклітинний домен notch взаємодіє з лігандом, металопротеаза родини ADAM під назвою ADAM10 розщеплює білок notch безпосередньо за межами мембрани. Це вивільняє позаклітинну частину білка (NECD - notch extracellular domain), яка продовжує взаємодіяти з лігандом. Потім ліганд разом з NECD піддаються ендоцитозу клітиною, що експресує ліганд, внаслідок чого після ендоцитозу можуть спостерігатися сигнальні ефекти в клітині, що експресувала ліганд; ця частина сигналізації notch є темою активних досліджень. Після цього першого розщеплення фермент під назвою γ-секретаза (яка бере участь у хворобі Альцгеймера) розщеплює залишок білка notch безпосередньо всередині внутрішнього шару мембрани клітини, що цей білок експресує. Це вивільняє внутрішньоклітинний домен білка notch (NICD - notch intracellular domain), який потім переміщується до ядра, де він може регулювати експресію генів шляхом активації фактора транскрипції CSL. Раніше вважалося, що ці білки CSL пригнічують цільову транскрипцію Notch. Проте подальші дослідження показали, що коли внутрішньоклітинний домен зв’язується з комплексом, він перемикається з репресора на активатор транскрипції. Інші білки також беруть участь у внутрішньоклітинній частині сигнального каскаду notch.

Взаємодія з лігандами

Ініціація Notch-сигналінгу відбувається, коли рецептори Notch на поверхні клітини зв'язують ліганди, експоновані на протилежних клітинах. У великому позаклітинному домені Notch критично важливими для взаємодії з Delta є саме домени 11 і 12 EGF Додаткові дослідження показали, що у зв’язуванні ліганду також беруть участь і області за межами Notch EGF11-12, як, наприклад, домен Notch EGF 8, що відіграє роль у селективному розпізнаванні Serrate/Jagged , та домени EGF 6-15, які необхідні для максимально ефективної передачі сигналів при стимуляції лігандом. Дослідження кристалічної структури взаємодіючих областей Notch1 і Delta-like 4 (Dll4) поглибили розуміння взаємодії між Notch-рецептором і лігандом на молекулярному рівні, і за їх допомогою було виявлено, що із вищезазначеними критичними Notch EGF доменами 12 взаємодіють N-кінцеві домени MNNL (або C2), а із EGF 11 - DSL домени лігандів. Кристалічна структура Notch1-Dll4 також висвітлила роль O-зв'язаних фукозних і глюкозних фрагментів Notch при розпізнаванні ліганду та забезпечила розуміння структурного механізму опосередкованої гліканами регуляції передачі сигналів Notch.

Синтетичний Notch-сигналінг Є можливим конструювання синтетичних рецепторів Notch шляхом заміни позаклітинних рецепторів і внутрішньоклітинних транскрипційних доменів іншими доменами на вибір, залежно від цілей дослідження. Обираючи, які ліганди будуть експоновані та розпізнані, можна таким чином обирати, які гени будуть активуватися у відповідь. З використанням цієї технології можливим є отримання клітин, які повідомлятимуть або змінюватимуть свою активність у відповідь на контакт із заданими сигналами, що є корисним як фундаментальних, так і прикладних досліджень передачі сигналів між клітинами. Примітно, що ця система дозволяє паралельно використання у клітині одразу кількох таких синтетичних шляхів.

Функції Сигнальний шлях Notch важливий для міжклітинної комунікації, яка включає механізми регуляції генів, які контролюють диференціацію клітин під час ембріонального розвитку та у дорослих організмів. Загалом передача сигналів Notch також відіграє роль у таких процесах:

нейрональний розвиток та функціонування нейронів регуляція артеріогенезу та ангіогенезу міжклітинні взаємодії між ендокардом і міокардом під час утворення примордіального клапана та розвитку і диференціювання шлуночків гомеостаз серцевого клапана, а також вплив на інші захворювання людини, пов’язані з серцево-судинною системою The notch signaling pathway in cardiac development and tissue homeostasis вчасна диференціація ендокринної та екзокринної лінії клітин підшлункової залози вплив на бінарну диференціацію клітин, які знаходяться на етапі вибору між секреторною та абсорбційною лініями розвитку в кишечнику розширення компартменту гемопоетичних стовбурових клітин під час розвитку кісток та участь у виборі лінії розвитку остеобластів, що свідчить про потенційну терапевтичну роль notch у регенерації кісток та остеопорозі експансія гемогенних ендотеліальних клітин за сигнальною віссю, в якій також бере участь Hedgehog-сигналізація та Scl комітування імунних клітин до Т-клітинної лінії розвитку від загального лімфоїдного попередника