Епігенетичне перепрограмування — стирання та ремоделювання епігенетичних позначок в молекулах ДНК, таких як сайти метилювання ДНК, — під час природнього розвитку організму, або в культурі клітин задля перетворення одного типу клітин на інший. Такий контроль також часто пов'язаний з модифікаціями гістонів, що, загалом, змінює активність певних генів, на рівні епігенома (див. Епігеноміка).
Феномен клітинного перепрограмування — здатність перетворювати один тип клітин в інший — викликав зміну парадигм в галузі молекулярної біології, що має далекосяжні наслідки для регенеративної медицини, моделювання захворювань і розуміння біології розвитку та клітинної ідентичності видів.
Тіло людини містить, за деякими оцінками, 400 основних у 60 підтипах тканин — але кожен тип клітин має однакову геномну послідовність ДНК — їх відрізняють саме зміни в епігеномі.
Історія Першою людиною, яка успішно продемонструвала перепрограмування, був Джон Гердон, який у 1962 році продемонстрував, що диференційовані соматичні клітини можуть бути перепрограмовані назад у ембріональний стан, коли йому вдалося отримати плаваючих пуголовків після перенесення диференційованих кишкових епітеліальних клітин у без’ядерні жаб’ячі яйця. За це досягнення він отримав Нобелівську премію з медицини 2012 року разом із Сін'я Яманакою. Яманака був першим, хто продемонстрував (у 2006 році), що цей процес перенесення ядра соматичної клітини або процес перепрограмування ооцитів (див. нижче), який виявив Гердон, можна повторити (на мишах) за допомогою певних факторів (Oct4, Sox2, Klf4 та c -Myc) для створення індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (iPSC). Також, з тією ж метою використовувалися інші комбінації генів, включаючи LIN25 і білок Homeobox NANOG; та комбінації хімічних речовин.
Основні поняття
Типи клітин і походження
Розуміння клітинної ідентичності починається з класифікації різних типів клітин і ліній їх розвитку. Клітини в організмі є високоспеціалізованими, вони виконують різні функції, життєво важливі для загальної фізіології.
Тіло людини містить, за деякими оцінками, 400 основних у 60 підтипах тканин — але кожен тип клітин має однакову геномну послідовність ДНК — їх відрізняють саме зміни в епігеномі.
Клітинна ідентичність глибоко переплетена з концепцією клітинної диференціації, коли стовбурові клітини стають спеціалізованими для виконання певних функцій в організмі. Процес диференціації організований точними генетичними та епігенетичними регуляторними механізмами, які гарантують, що кожен тип клітин зберігає свої унікальні характеристики. Ця концепція є наріжним каменем біології розвитку.
Епігенетика та епігеноміка Основа клітинної ідентичності виходить за межі генетичної інформації, закодованої в послідовності ДНК. Епігенетика та епігеноміка є ключовими аспектами, які керують клітинною диференціацією. Епігенетичні модифікації, такі як метилювання ДНК, модифікації гістонів і роль некодуючих РНК, відіграють ключову роль у визначенні моделей експресії генів.
Епігенетична спадковість Розуміння концепції епігенетичної спадковості є життєво важливим для оцінки ролі епігенетичних модифікацій у підтримці клітинної ідентичності через покоління. Епігенетичні зміни можуть передаватися від одного покоління до наступного і на них можуть впливати фактори навколишнього середовища та способу життя, потенційно впливаючи на здоров’я майбутніх поколінь.
Епігенетичне перепрограмування в природі Масштабні (від 10% до 100% епігенетичних позначок) і швидкі (від годин до кількох днів) перепрограмування відбуваються на трьох етапах життя ссавців. Майже 100% епігенетичних ознак перепрограмуються протягом двох коротких періодів на початку розвитку після запліднення яйцеклітини сперматозоїдом. Окрім цих трьох етапів, зміни до майже 10% метилювання ДНК в нейронах гіпокампу можуть відбуватись під час досвіду, що викликає формування в пам'яті сильної енграми, емоційно забарвленої страхом.
Після запліднення у ссавців моделі метилювання ДНК значною мірою стираються, а потім відновлюються під час раннього ембріонального розвитку. Майже всі метилювання від батьків стираються, спочатку під час раннього ембріогенезу, а потім знову в гаметогенезі, де кожного разу відбуваються деметилювання та реметилювання. Деметилювання під час раннього ембріогенезу відбувається в передімплантаційний період. Після запліднення сперматозоїдом яйцеклітини з утворенням зиготи відбувається швидке деметилювання батьківської ДНК і повільніше деметилювання материнської ДНК до утворення морули, яка майже не має метилювання. Після утворення бластоцисти може початися метилювання, а з утворенням епібласта відбувається хвиля метилювання до стадії . Інший період швидкого і майже повного деметилювання відбувається під час гаметогенезу в примордіальних зародкових статевих клітинах. За винятком цих статевих клітин, на постімплантаційній стадії моделі метилювання в соматичних клітинах є стадійно- тканиноспецифічними зі змінами, які, імовірно, визначають кожен окремий та зберігаються стабільно протягом тривалого часу.
Ембріональний розвиток
Геном сперми миші на 80–90% метильований у CpG-сайтах у ДНК, що становить близько 20 мільйонів метильованих сайтів. Після запліднення батьківська хромосома майже повністю за шість годин активним процесом перед реплікацією ДНК (синя лінія на малюнку). У зрілому ооциті близько 40% його сайтів CpG метильовані. Деметилювання материнської хромосоми в основному відбувається шляхом блокування дії метилюючих ферментів на ДНК материнського походження та розведення метильованої материнської ДНК під час реплікації (червона лінія на малюнку). Морула (на стадії 16 клітин) має лише невелику кількість метилювання ДНК (чорна лінія на малюнку). Метилювання починає збільшуватися через 3,5 дня після запліднення в бластоцисті, а потім велика хвиля метилювання відбувається на 4,5-5,5 день в епібласті, переходячи від 12% до 62% метилювання та досягаючи максимального рівня після імплантації в матці. На сьомий день після запліднення новоутворені примордіальні зародкові статеві клітини (PGC) в імплантованому ембріоні відокремлюються від решти соматичних клітин. У цей момент PGC мають приблизно такий же рівень метилювання, як і соматичні клітини.
Новоутворені примордіальні зародкові клітини (PGC) в імплантованому ембріоні походять від соматичних клітин. У цей момент PGCs мають високий рівень метилювання. Ці клітини мігрують від епібласта до . На цьому етапі клітини швидко розмножуються і починають деметилювання двома хвилями. У першій хвилі деметилювання відбувається шляхом реплікативного розведення, але в другій хвилі деметилювання відбувається в результаті активного процесу. Друга хвиля призводить до деметилювання специфічних локусів. На цьому етапі геноми PGC демонструють найнижчий рівень метилювання ДНК серед будь-яких клітин за весь життєвий цикл [на 13,5 день ембріона (E13.5), див. другий малюнок у цьому розділі].
Після запліднення деякі клітини новоутвореного ембріона мігрують до гонадного гребаня і згодом стають статевими клітинами (сперматозоїдами і яйцеклітинами) наступного покоління. Завдяки феномену геномного імпринтингу материнський і батьківський геноми позначаються по-різному і повинні бути належним чином перепрограмовані кожного разу, коли вони проходять через зародкову лінію. Таким чином, під час процесу гаметогенезу первинні зародкові клітини мають стерти та відновити оригінальні схеми метилювання двобатьківської ДНК на основі статі батька-передавача.
Після запліднення батьківський і материнський геноми деметилюються, щоб стерти їхні епігенетичні підписи та набути тотипотентності (див. ). У цьому місці спостерігається асиметрія: чоловічий пронуклеус піддається швидкому і активному деметилюванню. Тим часом жіночий пронуклеус пасивно деметилюється під час послідовних клітинних поділів. Процес деметилювання ДНК включає репарацію основи та, ймовірно, інші механізми, засновані на репарації ДНК. Незважаючи на глобальний характер цього процесу, існують певні послідовності, які уникають його, такі як (DMRS), пов’язані з імпринтованими генами, та центромерний гетерохроматин. Реметилювання знову необхідне для диференціації ембріона в повноцінний організм.
Ще в 2003 році було показано, що маніпуляції з ембріонами до імплантації in vitro порушують схеми метилювання в імпринтованих локусах і відіграють вирішальну роль у клонованих тваринах.
Навчання і пам'ять
Навчання та пам’ять мають рівні постійності, що відрізняється від інших психічних процесів, таких як мислення, мова та свідомість, які є тимчасовими за своєю природою. Навчання та запам’ятовування можуть накопичуватися повільно (як-от вивчення таблиці множення) або швидко (як-от доторкнувшись до гарячої печі), але коли вони досягнуті, їх можна відновити для свідомого використання протягом тривалого часу. (див. також Нейропластичність)
Щури, піддані одному випадку контекстного обумовлення страху, створюють особливо сильну довготривалу пам’ять. Через 24 години після навчання 9,17 % генів у геномах нейронів гіпокампу щурів виявилися диференціально метильованими. Це включало понад 2000 диференціально метильованих генів через 24 години після тренування, при цьому понад 500 генів були деметильовані. Ділянка гіпокампу мозку – це місце, де спочатку зберігаються контекстуальні спогади про страх, але це зберігання є тимчасовим і не залишається в гіпокампі. У щурів контекстне обумовлення страху скасовується, коли гіпокамп піддається видаленню лише через 1 день після кондиціонування, але щури зберігають значну кількість контекстуального страху, коли встановлюється велика затримка (28 днів) між часом кондиціонування та часом гіпокампектомії (видалення гіпокампу).
Молекулярні стадії Для перепрограмування метилома ДНК потрібні три молекулярні стадії.
Етап 1: Рекрутинг. Ферменти, необхідні для перепрограмування, залучаються до ділянок геному, які вимагають деметилювання або метилювання. Етап 2: Реалізація. Відбуваються початкові ферментативні реакції. У випадку метилювання це короткий етап, який призводить до метилювання цитозину до 5-метилцитозину. Етап 3: Репарація ДНК шляхом висічення основи. Проміжні продукти деметилювання каталізуються специфічними ферментами основного шляху репарації ДНК шляхом ексцизії, які остаточно відновлюють цитозин у послідовності ДНК.
Ферменти ТЕТ Ізоформи ферментів TET включають щонайменше дві ізоформи ТЕТ1, одну із ТЕТ2 і три ізоформи ТЕТ3. Повнорозмірна канонічна ізоформа TET1, здається, практично обмежена ранніми ембріонами, ембріональними стовбуровими клітинами та первинними зародковими клітинами (PGC). Домінуюча ізоформа TET1 у більшості соматичних тканин, принаймні у миші, виникає внаслідок використання альтернативного промотору, який призводить до короткого транскрипту та усіченого білка, позначеного як TET1. Ізоформами TET3 є повнорозмірна форма TET3FL, коротка форма сплайсингу TET3s і форма, яка зустрічається в ооцитах і нейронах, позначена як TET3o. TET3o створюється альтернативним використанням промотора та містить додатковий перший N-кінцевий екзон, що кодує 11 амінокислот. TET3o зустрічається лише в ооцитах і нейронах і не експресується в ембріональних стовбурових клітинах або в будь-якому іншому типі клітин або досліджуваних тканинах дорослих мишей. У той час як експресію TET1 ледве можна виявити в ооцитах і зиготах, а TET2 експресується лише помірно, варіант TET3 TET3o демонструє надзвичайно високі рівні експресії в ооцитах і зиготах, але майже відсутній на 2-клітинній стадії. Можливо, що TET3o з високим вмістом в нейронах, ооцитах і зиготах на одноклітинній стадії є основним ферментом TET, який використовується, коли в цих клітинах відбувається дуже масштабне швидке деметилювання.
Рекрутинг TET до ДНК