Pragnął wydać własny przekład Nowego Testamentu na łacinę, jednak nie mógł znaleźć wydawcy. Przygotował więc Novum Instrumentum omne – Nowy Testament grecko-łaciński (tekst łaciński to jego własny przekład). Wydanie to wzbudziło zainteresowanie prawdami wiary pierwotnego Kościoła i przyczyniło się do zakwestionowania wielu katolickich doktryn, przez co wywołało szerokie kontrowersje. Utorowało także drogę do przekładów Biblii na języki narodowe. Jednym z nich był niemiecki przekład Nowego Testamentu przygotowany przez Marcina Lutra. Erazm zachęcał osoby świeckie do czytania Pisma Świętego i popierał działalność reformatora. W liście do elektora saskiego Fryderyka Mądrego pisał, że „grzechem” Lutra jest to, że „naruszył tiarę papieża i brzuchy mnichów”, a w liście do papieża Leona X nazwał go „potężną trąbą ewangelii prawdy”. W późniejszym czasie poróżnił się z Lutrem w kwestii wolnej woli człowieka, pozostał jednak zwolennikiem reform w Kościele oraz nawoływał do powrotu do nauki Chrystusa.