Trzeboń był wzmiankowany po raz pierwszy w 1262 r. jako osada handlowa, usytuowana wśród rozległych mokradeł. Leżał w dobrach panów z Landštejnu – jednej z gałęzi możnego rodu Vitkovców. Już pod koniec XIII w. otaczał go ciąg miejskich umocnień, a w 1341 r. występował już jako miasto. Od połowy XIV w. w miejscu dzisiejszego zamku istniał już pierwszy zameczek Landštejnów otoczony fosami (czes. Vodní hrad). W 1366 roku odziedziczyli go Rožmberkowie. Dzięki nim Trzeboń uzyskał przywileje takie, jakie przysługiwały miastom królewskim: możliwość budowy kamiennych murów z fosami, prawo organizowania targów i corocznych jarmarków oraz wolny import soli. Powstał klasztor, przytułek miejski („szpital”) i browar.
W 1479 roku władzę nad majątkiem Rožmberków objął Vok z Rožmberka, który wybrał Trzeboń na swoją siedzibę. W następnych dziesięcioleciach znaczenie miasta wzrosło, gdy w jego okolicy rozpoczęto budowę systemu stawów rybnych i zasilających je kanałów, w tym opływającego miasto od wschodu kanału Zlatá stoka (1508-1518) oraz podchodzącego od południa ku murom miejskim wielkiego stawu Svět (1571-1574). W tym czasie zaczęto intensywnie rozwijać też gospodarkę rybacką. W 1562 r. nawiedził Trzeboń wielki pożar. Spłonęło podczas niego czterdzieści osiem domów i część zespołu zamkowego.