Podczas powstania styczniowego (1863-1864) mieszkańcy Włodawy oraz rejonu włodawskiego nie byli bierni i włączyli się w nurt działań patriotycznych oraz polskich walk narodowowyzwoleńczych. Okolice Włodawy wielokrotnie były areną walk i potyczek w trakcie insurekcji przeciwko rosyjskiemu zaborcy, miały one miejsce w Adamkach (7 marca 1863 r.), Lucie (7 marca 1863 r.), Suchawie i Wyrykach (6 lipca 1863 r.), Urszulinie (7 lipca 1863 r.) i Wytycznie (7 listopada 1863 r.). W różnych okresach przebywały tu niemal wszystkie większe oddziały podlaskie, dowodzone przez aktywnych i zasłużonych dowódców powstańczych w rejonie Włodawy, m. in. Karola Krysińskiego czy Marcina Borelowskiego „Lelewela”. Następstwem klęski powstania były represje władz carskich, nasilenie rusyfikacji i prześladowania religijne unitów, ale i katolików łacińskich. Zlikwidowano jedyną w mieście placówkę oświatową i skasowano zakon paulinów. W wyniku represji wiele miast utraciło prawa miejskie. Włodawa nie została jednak ich pozbawiona. Po powstaniu styczniowym Włodawa utraciła status miasta prywatnego, stając się własnością rządu carskiego.