miniatura|Microplaca ELISA|311x311px L'enzimoimmunoassaig sobre fase sòlida (ELISA, de l'anglès, enzyme-linked immunosorbent assay) és una tècnica bioquímica que es basa en l'ús d'antígens o anticossos marcats amb un enzim, de manera que els conjugats resultants tinguin activitat tant immunitària com enzimàtica. És necessari que un dels components (antigen o anticòs) estigui marcat amb un enzim i insolubilitzat sobre un suport immunoabsorbent per tal que la reacció antigen-anticòs quedi immobilitzada i d'aquesta manera pugui ser mesurada fàcilment mitjançant l'addició d'un substrat específic que, en interaccionar amb l'enzim, produirà un color visible a simple vista i quantificable mitjançant l'ús d'un espectrofotòmetre o un colorímetre.
Aquest assaig d'immunoabsorció associat a un enzim permet detectar menys d'un nanogram (10–9 g) d'una proteïna.
Història ELISA és un assaig que va desenvolupar el grup de recerca de Peter Perlmann i Eva Engvall a la Universitat d'Estocolm (Suècia). Als Països Baixos, de manera independent però simultània, el grup d'Anton Schuurs i Bauke van Weemer va crear l'EIA (enzyme immunoassay). Aquests dos mètodes van ser inventats a la dècada de 1960 però el seu desenvolupament i ús va arribar durant les dues dècades següents.
Tot i que les tècniques EIA i ELISA diferien en el disseny de l'assaig, els dos mètodes estaven basats en el principi de l'immunoassaig: utilitzar un enzim en comptes de radioactivitat, com ho feia el radioimmunoassaig (RIA). En aquesta última tècnica, descrita el 1960 per Solomon Berson i Rosalyn Yalow a Nova York, la radioactivitat produïa un senyal que indicava si en la mostra hi havia present un antigen o anticòs específic.
ELISA va sorgir com una alternativa al radioimmunoassaig, ja que és més segura, sobretot per a la salut del personal del laboratori i pels residus creats, i més econòmica. La idea d'aquest nou procediment era poder utilitzar marcadors enzimàtics, molècules grans i voluminoses, i que no interferissin en la reacció antigen–anticòs. Va ser rebuda amb molt d'escepticisme, però els resultats dels primers experiments van ser encoratjadors.
Entre 1966 i 1969, un grup a Villejuif (França) liderat per Stratis Avrameas va exposar els seus resultats favorables d'acoblament antigen-anticòs amb enzims com ara la fosfatasa alcalina o la glucosa oxidasa. Volien utilitzar els antígens i anticossos units a enzims per detectar anticossos o antígens en un sèrum problema per immunofluorescència i aplicar aquestes noves eines en histopatologia. G.B. Pierce, a Los Angeles, juntament amb altres investigadors, va seguir aquesta línia de recerca, mentre que L. Wide d'Uppsala, a Suècia, va desenvolupar una tècnica de (radio)immunoabsorció en la qual els anticossos eren insolubilitzats mitjançant el seu acoblament a cel·lulosa o a perles de Sephadex, un gel dextrà.
L'any 1971, Engvall i Perlmann van publicar un experiment en el qual mesuraven la quantitat d'immunoglobulina G de sèrum de conill amb fosfatasa alcalina com a marcador. Aquest mateix any, van Weemen i Schuurs van publicar el seu treball sobre EIA i demostraren que era possible quantificar concentracions de gonadotropina coriònica en orina usant l'enzim peroxidasa de rave picant.
En la comercialització de kits d'EIA i ELISA es van aplicar tècniques de fase sòlida per al desenvolupament de plaques de microtitulació (96 cel·les) en les quals un antigen o bé un anticòs estaven units no covalentment amb el suport de fase sòlida. La comercialització d'aquestes plaques va comportar a la vegada avenços en la fabricació de pipetes automatitzades o lectors de paques, entre d'altres. Els test EIA i ELISA, dels quals van aparèixer ràpidament variants, no van ser del tot reeixits fins que, entre el final de la dècada de 1970 i l'inici de la de 1980, van aconseguir tenir l'alta sensibilitat del radioimmunoassaig.
Aquest immunoassaig ha suposat un gran avenç científic en molts camps. En l'àmbit clínic, per exemple, ja en les dècades de 1970 i 1980 van permetre la detecció de partícules víriques com les que ocasionen l'hepatits B, la detecció d'anticossos del virus de la immunodeficiència humana, d'anticossos de toxoplasma i rubèola, etc.
Principis (fonaments bàsics) La prova ELISA es basa en una reacció d'antigen–anticòs, un dels dos amb reactivitat coneguda. Els antígens o anticossos de la mostra s'immobilitzen sobre un suport sòlid. Posteriorment s'afegeix un anticòs o antigen específic addicional sobre la superfície i es produeix la interacció antigen–anticòs. Aquest anticòs o antigen addicional està unit a un enzim o per si sol pot ser detectat per un anticòs secundari vinculat a un enzim a través de bioconjugació. En l'etapa final, s'afegeix una substància que conté el substrat de l'enzim. Això donarà lloc a una reacció amb un senyal detectable, com per exemple un canvi de color.
Després d'afegir l'enzim, és necessari que passi un cert temps. Si aquest no és suficient perquè es produeixi la reacció, no s'apreciarà cap color; per tant, el resultat interpretat serà erroni, donarà lloc a un fals negatiu i farà que disminueixi la sensibilitat de la tècnica.
Per altra banda, la temperatura també influeix en l'aparició de falsos negatius. Si la temperatura d'incubació és molt baixa, no es completarà la formació del complex antigen–anticòs. D'altra banda, si és molt alta, les proteïnes (antigen i anticòs) es desnaturalitzaran i disminuirà la seva capacitat per interaccionar, donant també falsos negatius.
També poden donar-se falsos positius; per exemple, quan es fa servir molt antigen o anticòs. Si en canvi se'n fa servir massa poc, donarà un fals negatiu.
Característiques La tècnica ELISA té moltes de les propietats d'un immunoassaig ideal, proporcionant una sèrie d'avantatges:
Senzillesa: s'observa en molts aspectes de la tècnica com per exemple en l'addició dels reactius en petites quantitats i la senzilla separació dels reactius lliures que no han quedat units amb un simple rentat, entre d'altres. Lectura: el producte que en resulta té color i pot ser observat a simple vista per comprovar que la tècnica hagi funcionat. A més a més, els resultats es poden examinar fàcilment i de manera exacta i objectiva amb un espectrofotòmetre o colorímetre. Rapidesa: és una prova reproduïble en poques hores i els resultats són llegits ràpidament amb un sol aparell. Sensibilitat: l'ELISA és capaç de detectar concentracions molt petites (d'entre 0,01 i 1 µg/mL) de la molècula que es vol estudiar, característica ideal per als diagnòstics. Reactius: en el mercat, se'n pot trobar una gran diversitat i específics per als procediments ELISA. Adaptabilitat: se n'han desenvolupat diferents models per a utilitzar en més situacions diferents. Cost: el procediment i els reactius són força econòmics. Acceptabilitat: és utilitzada en molts camps de la ciència i molt reconeguda. Seguretat: tant el procediment com els reactius utilitzats no suposen cap risc per la salut. Disponibilitat: és un procediment reproduïble en qualsevol laboratori. Equips: existeix una àmplia varietat d'equips o "kits" ja preparats per a dur a terme la prova de manera encara més senzilla. Estandardització: la quantificació de les dades obtingudes permet l'estandardització dels valors.
En resum, l'ELISA és una prova versàtil, robusta, simple de realitzar, amb reactius econòmics i, aconsegueix mitjançant l'ús de la fase sòlida una separació fàcil entre la fracció retinguda i la fracció lliure.
A més a més, s'han proposat i desenvolupat diferents mètodes d'amplificació del senyal (luminescència, cascades enzimàtiques, etc.) que han permès incrementar la sensibilitat d'alguns ELISA respecte a l'obtinguda en la RIA (radioimmunoassaig) hormonal.
No obstant això, també presenta algun inconvenient. Per exemple, el mètode d'immobilització de l'antigen no específic; quan el serum es fa servir per a fer la prova d'antigen, totes les proteïnes en la mostra poden adherir-se a la microplaca, així que petites concentracions del que s'analitza han de competir amb altres proteïnes del sèrum en enllaçar a la superfície. La facilitat de les immunoglobulines sèriques per adherir-se al plàstic de les microplaques pot ser causant de falsos positius.
Tècnica de l'ELISA miniatura|ELISA(ms)|569x569px Hi ha diferents tipus d'ELISA encara que presenten alguns punts en comú.
Adsorció de l'antigen o anticòs a la fase sòlida de plàstic La fase sòlida ha de ser d'un tipus que permeti un maneig fàcil, així com la reproductibilitat de la unió d'antígens o anticossos sobre la seva superfície. La fase sòlida més utilitzada és la gradeta de 96 cel·les feta de clorur de polivinil (plaques flexibles) i de poliestirè (plaques rígides i inflexibles). Per a treballs rutinaris de diagnòstic en els quals se sensibilitza la placa amb immunoglobulines i en els quals no es desitgi una quantificació de resultats ni calguin dades excessivament repetibles, qualsevol tipus de placa pot ser vàlid. En altres treballs, particularment en els quals es revesteix la placa d'antigen, la qualitat de la microplaca és crítica. En cas d'utilitzar un mètode d'espectrofotometria per llegir els resultats és recomanable una gradeta amb unitats de fons pla i en cas que la lectura la fem visualment (a ull) utilitzaríem gradetes de fons rodó.
Aquest primer pas consisteix en el revestiment de la placa amb antígens o anticossos. Els antígens i anticossos s'enganxen fàcilment a la superfície de la fase sòlida per adsorció passiva. La majoria de proteïnes s'absorbeixen a superfícies de plàstic, probablement com a resultat d'interaccions hidròfobes entre les estructures no polars de la proteïna i la matriu del plàstic. La fixació o entapissat amb immunoglobulines sol realitzar-se mitjançant incubació en tampó carbonat pH 9,6 entre 1 a 3 hores a 35 o 37 °C.
Rentat El propòsit del rentat és el de separar els reactius units a la gradeta o a qualsevol altre reactiu (que estigui unit a la gradeta) i els que estan lliures. En primer lloc, s'han de buidar tots els pouets de la gradeta i posteriorment s'ha d'afegir un líquid dins d'aquests. Aquest procés s'ha de repetir almenys 3 cops. El líquid utilitzat per rentar està habitualment tamponat, normalment amb PBS (0.1M, pH 7.4), per mantenir la isotonicitat, ja que la majoria de reaccions antigen-anticòs són òptimes sota tals condicions. El rentat es realitza diversos cops en diferents punts del procediment depenent del tipus d'ELISA que es realitzi.
Addició dels reactius En l'ELISA, s'afegeixen antígens o anticossos específics pels reactius que revesteixen les cel·les. Els immunoassajos impliquen l'administració precisa dels reactius en volums relativament petits. Els volums utilitzats habitualment en l'ELISA es troben en el rang de 50 o 100 µm per cada cel·la de la placa.
Incubació dels reactius La reacció entre antigen i anticòs depèn de la seva proximitat. Durant l'ELISA això es veu afectat per les seves respectives concentracions, distribució, temps, temperatura d'incubació i pH (tampó). En cada una de les interaccions cal tenir en compte l'afinitat de l'anticòs amb l'antigen. Trobem dos tipus de condicions en la incubació: incubació de plaques rotants (amb sacseig) i incubació amb plaques estacionàries. Aquestes condicions afecten el temps i la temperatura adequats per realitzar l'ELISA amb èxit.
Conjugació amb enzims L'addició de reactius conjugats amb enzims és intrínsec en l'ELISA. L'enzim ha de tenir un substrat cromogènic o fluorogènic, que serà afegit més endavant en el procediment. La taxa de desenvolupament del color serà proporcional, durant un determinat interval, a la quantitat d'enzim conjugat present i a la concentració de producte de la catàlisi del substrat.
Reaccions de parada