L'ATPmétrie (ou ATP-métrie) est une technique de biologie moléculaire, basée sur le principe de la bioluminescence, qui permet de mesurer quasi instantanément la quantité d'ATP (Adénosine Tri-Phosphate) présente dans un échantillon.
L'ATP est la première source d'énergie de toute cellule vivante. Toute cellule vivante en produit et en consomme. De ce fait, toute trace d'ATP est le témoin d'une trace de vie. Ainsi, quantifier l’ATP présent dans des cellules permet de quantifier les micro-organismes totaux (flore totale ou biomasse totale). La mesure se fait à l’aide d’un luminomètre qui donne le résultat en quelques secondes en Unité Relative de Lumière (URL ou RLU en anglais).
L’ATP-métrie possède de nombreuses applications dans des domaines très variés tels que le contrôle microbiologique des eauxRaymond M (2006). L'ATP-métrie: de nombreuses applications dans le domaine du contrôle des eaux. L'Eau, l'industrie, les nuisances, (297), 81-84., de diverses boissonsOrmières, J. F., Lurton, L., & Cao-Thanh, B. (2000). Contrôle microbiologique des vins: utilisation de l'ATP-metrie. In Congrès Mondial de la Vigne et du Vin: Paris 19-23 juin/June/Junio 2000 (). Office International de la Vigne et du Vin.Ormières, J. F., Lurton, L., & Cao-Thanh, B. (2000). Contrôle microbiologique des vins: utilisation de l'ATP-metrie. In Congrès Mondial de la Vigne et du Vin: Paris 19-23 juin/June/Junio 2000 (). Office International de la Vigne et du Vin., de surfaces en industrie agroalimentaire (HACCP) ou dans les piscines, et même de l’air.
Principe général thumb|Schéma général des réactions de bioluminescences L'ATP-métrie est une technique de mesure basée sur le principe de la bioluminescence. La réaction de bioluminescence est catalysée par une enzyme produite par la luciole : la luciférase. Cette réaction a lieu grâce à l’activation de la luciférine, en présence d’oxygène et de magnésium, par l'hydrolyse d'adénosine triphosphate (ATP). Si les concentrations en luciférine-luciférase et en oxygène sont maintenues constantes, alors l'intensité lumineuse est proportionnelle à la quantité d'ATP. En utilisant la luciférine et la luciférase de la luciole, il est donc possible, grâce à un luminomètre d’avoir une évaluation de la contamination d’un échantillon.
L’ATPmétrie est une mesure de flore totale, c’est-à-dire qu’elle ne permet pas d'identifier les bactéries ou autres espèces spécifiquement. Elle est utilisée comme indicateur pour estimer le risque de contamination d’une eau par des micro-organismes pathogènes comme pour la surveillance du risque Légionelle. Elle permet le suivi d’une installation mais aussi d’établir la cartographie d’un réseau d’eau ou d’air afin d’identifier les points critiques.
ATPmétrie qualitative ( génération) L’ATPmétrie qualitative existe depuis les années 1980. Cette technique se présente généralement sous la forme d’un « stylo » intégrant un coton-tige ou des ailettes pour le prélèvement, et le réactif de mesure dans la partie haute.
La mesure de bioluminescence ne prend que quelques secondes et se fait à l’aide d’un luminomètre qui donne le résultat en RLU. Or, selon le prélèvement, l’âge de l’enzyme, le luminomètre utilisé ou les conditions d’analyse (pH, température, inhibiteurs ou activateurs) les RLU pour une même quantité d'ATP peuvent varier de façon très importante. Ceci rend les comparaisons difficiles d’un prélèvement à l’autre et impossible d’un type de luminomètre à l’autre. Cette approche est cependant très utilisée pour des analyses « propre vs sale ».
Sur les surfaces L’ATP-métrie qualitative est principalement utilisée pour le contrôle des surfaces en agroalimentaire dans les approches de type HACCP. Le prélèvement de l’échantillon se fait par frottement d’un écouvillon sur la surface à contrôler. L’écouvillon est ensuite mis en contact avec les réactifs pour démarrer la réaction de bioluminescence.
Cette méthode donne un état de propreté de la surface mais ne permet pas de connaitre la quantité de micro-organismes présents. Seule une réponse « positif/négatif » est obtenue.
L’absence de standardisation de la méthode rend son utilisation délicate en milieu industriel avec des résultats peu interprétables.
Dans l'eau L’ATP-métrie qualitative est aussi utilisée pour le contrôle des eaux fortement chargées en bactéries. Le prélèvement de l’échantillon se fait par trempage de l’écouvillon dans l’eau à analyser. Seuls approximativement 100 µl d’échantillon sont analysés rendant la fiabilité de la mesure très faible. En effet, l’échantillon prélevé n’est pas représentatif de l’eau analysée et les seuils de sensibilité sont très élevés. Pour remédier à ce problème il est possible de faire plusieurs analyses de la même eau (3 à 5) afin de faire une moyenne des résultats.
De la même façon que pour les surfaces, seule une réponse « positif/négatif » est obtenue car il n’y a pas de calibration de la mesure.
ATPmétrie quantitative ( génération) vignette|Protocole de mesure par ATPmétrie quantitative Cette évolution de l’ATPmétrie intègre la calibration de la mesure par l’utilisation d’un standard pour passer des RLU au picogramme d’ATP. Il a été établi que lorsque la biomasse totale est considérée, chaque bactérie contient en moyenne 1 femtogramme d’ATP (Wilfred, 1991). Ainsi, il est possible d’estimer la quantité de bactéries présente dans un échantillon en prenant pour convention : 1 pg d’ATP ≈ équivalents bactéries.
L’ATPmétrie génération intègre aussi le plus souvent une étape de filtration.
Utilisation d'un étalon Il s’agit de l’addition d’une quantité connue d’ATP. Cet ajout peut être externe ou interne.
En effet, la réaction de bioluminescence étant régie par une enzyme, elle est sensible à l’environnement : température extérieure, température et pH de l’échantillon, présence d’inhibiteurs ou activateurs, état de l’enzyme, etc. mais aussi au type de luminomètre utilisé. De ce fait, l’interprétation des RLU seuls n’est pas pertinente. L’utilisation d’un témoin interne (ajout dosé) ou externe permet la calibration la mesure. L’ajout dosé interne présente l’avantage de prendre en compte toutes les contraintes environnementales agissant sur l’enzyme pour chaque échantillon (température, pH, teneur en sel, inhibiteurs…).
La standardisation permet d’avoir un résultat quantitatif et exploitable sans que la manipulation ne soit ni plus longue et ni plus coûteuse.
La filtration de l'échantillon Suivant les approches, l’étape de filtration peut concentrer quelques millilitres d’échantillon à plus d’un litre. L’utilisation d’une étape de filtration présente de nombreux atouts : Large gain en sensibilité de la mesure. Grâce à cette étape, l’ATPmétrie a pu être utilisée pour le contrôle des eaux ultra-pures. Bonne représentativité de l’échantillon en prélevant un volume plus grand que ce que permet l’ATPmétrie génération. Élimination de l’ATP libre. Ainsi, seul l’ATP intracellulaire, contenu dans les cellules intactes, est mesurée.
Après l’étape de filtration, une solution de lyse est utilisée afin de lyser les bactéries et faire sortir l’ATP intracellulaire dans le milieu réactionnel.
Performances Grâce à la filtration et à la standardisation, l’ATPmétrie quantitative est devenue une méthode très robuste, d’autant plus si elle utilise la technique d’ajout dosé interne. Les contraintes de l’environnement n’affectent pas le résultat. Une estimation de la flore totale contenue dans l’échantillon est alors possible.
Cette méthode d’analyse est très sensible et permet d’atteindre des seuils limites de détection, allant jusqu’à 0,1 pg d'ATP par litre soit 100 équivalents bactéries dans 1 litre.
Le majeur atout de cette technique, est qu’elle est facilement utilisable sur le terrain et donne des résultats en temps réel. L’analyse complète peut être effectuée en moins de 2 min.
Applications Dans l'eau L’ATPmétrie est un excellent indicateur du niveau de développement de la biomasse et donc du niveau de risque. En effet, la colonisation des surfaces (paroi des conduites d'eau, des systèmes de climatisation) par de la biomasse ou des biofilms est un facteur important du risque de développement des LégionellesGarrelly, L., & Raymond, M. (2007). L'ATP-métrie: un outil de surveillance en temps réel du risque légionelles sur les tours aéroréfrigérantes et réseaux d'eaux. L'Eau, l'industrie, les nuisances, (298), 53–56.Magdo, C. (2008). Maîtrise du risque légionelle : Mise en place d'un suivi de la biomasse active par ATP-métrie sur des circuits de refroidissement. TSM. Techniques sciences méthodes, génie urbain génie rural, (résumé). et d'autres bactéries comme Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.
La surveillance de la biomasse active permet donc d’estimer le risque et de le contrôler. Les coûts de charges d’une installation et son impact sur l’environnement sont ainsi réduits par l’optimisation de l’utilisation des biocides.
La rapidité de cette méthode permet un contrôle quotidien afin de réagir rapidement à toute variation de la biomasse dans une installation, contrairement aux méthodes classiques comme la culture cellulaire ou la PCR quantitativeChampiat, D., & Larpent, J.P. (date ?). Biologie des eaux : méthodes et techniques 1988-1994. Ed. Masson..
L’ATPmétrie quantitative est aussi un très bon outil de diagnostic des réseaux car elle permet de localiser rapidement un élément défaillant, la présence de bras morts ou des problèmes homogénéisation d’un biocide dans une zone de stockage.
Eaux industrielles L’usage de l’ATPmétrie est largement répandu dans les tours aéroréfrigérantes où le risque légionelle est très présent. Elle est alors couramment utilisée en biosurveillance pour anticiper les dérives et éviter les dépassements réglementaires.
Eau chaude sanitaire Les eaux chaudes sanitaires sont également sensibles au développement des légionelles dans les conduites. L’ATPmétrie est utilisée pour prévenir ce risque.
Eau potable Grâce à des limites de détection et quantification de plus en plus basse, l’ATPmétrie est aujourd’hui utilisée pour le contrôle des eaux destinées à la consommation humaine. Elle peut servir aussi bien pour l’analyse de la filière de traitement que pour le contrôle du réseau de distribution d'eau potable. Cet outil d’analyse extrêmement rapide et de terrain permet d’anticiper les dérives et les dépassements réglementaires. Les seuils communément admis sont de 0,1 pg d’ATP par millilitre en sortie de la filière de production, et 0,5 pg d'ATP dans le réseau de distribution.
Eau de station d'épuration L’ATPmétrie y est utilisée pour connaître l’état de santé de la biomasse active afin d’optimiser les conditions de fonctionnement de la STEP.
Eau de ballaste L’ATPmétrie est utilisée pour prévenir le risque sanitaire.
Eau ultra-pure L’ATPmétrie est utilisée pour le contrôle des eaux ultra-pures dans le domaine de la microélectronique ou de la dialyse par exemple.
Bain de rinçage L'ATPmétrie est aussi utilisée pour contrôler le développement des bactéries dans les bains de rinçage en galvanoplastie de luxe.
Sur les surfaces Le contrôle de la propreté des surfaces passe souvent par une simple inspection visuelle. Cependant, cela n’est pas suffisant pour évaluer correctement l’état microbiologique de la surface. L’ATPmétrie est une méthode permettant d’avoir une idée plus précise.
Elle est largement répandue dans le domaine agroalimentaire, principalement sous la forme qualitative. Cependant, face au peu de fiabilité de cette méthode, de plus en plus d’industriels se tournent vers l’ATPmétrie quantitative qui présente l’intérêt de pouvoir caractériser le niveau de saleté. Elle permet le contrôle des surfaces afin de valider les procédés de nettoyage et désinfection mis en place.