O ARN que interacciona con piwi ou ARN asociado a piwi, abreviado como piRNA (piwi-interacting RNA), é o tipo máis longo de moléculas de ARN pequeno non codificante que se expresa nas células animais e considérase unha clase de ARN interferente.Molecular Biology Select. Cell, 2006. 126(2): p. 223, 225-223, 225.Seto, A.G., R.E. Kingston, and N.C. Lau, The Coming of Age for Piwi Proteins. Molecular Cell, 2007. 26(5): p. 603-609. Os piRNA forman complexos ARN-proteína coas chamadas proteínas piwi, o que lles dá o seu nome. Estes complexos de piRNA foron asociados co silenciamento de xenes de retrotransposóns tanto epixenético coma postranscricional e doutros elementos xenéticos en células da liña xerminal, particularmente as células da espermatoxénese Siomi MC, Sato K, Pezic D, Aravin AA: PIWI-interacting small RNAs: the vanguard of genome defence. Nat Rev Mol Cell Biol 2011, 12:246-258.. Son diferentes dos microARN (miRNA) en tamaño (26–31 nucleótidos en vez de 21–24), ausencia de secuencias conservadas, e maior complexidade.
Non está aínda claro como se xeran os piRNA, pero suxeríronse varios modos posibles, e é seguro que a vía da súa bioxénese é distinta da dos microARN e siRNA, mentres que os rasiRNA considéranse unha subespecie dos piRNA.Klattenhoff, C. and W. Theurkauf, Biogenesis and germline functions of piRNAs. Development, 2008. 135(1): p. 3-9.
Características Os piRNA foron detectados tanto en vertebrados coma en invertebrados, e aínda que a bioxénese e modos de acción varía algo entre especies, certo número de características están conservadas. Os piRNAs non teñen un motivo de estrutura secundaria claro, a lonxitude dun piARN é, por definición, entre 26 e 31 nucleótidos, e a tendencia a ter UMP no extremo 5' é común aos piRNA de vertebrados e invertebrados. Os piRNA de Caenorhabditis elegans teñen un monofosfato no extremo 5’ e unha modificación no extremo 3' que bloquea os osíxenos en posición 2' e 3',Ruby, J.G., et al., Large-Scale Sequencing Reveals 21U-RNAs and Additional MicroRNAs and Endogenous siRNAs in C. elegans. 2006. 127(6): p. 1193-1207. e isto tamén se confirmou en Drosophila melanogaster,Vagin, V.V., et al., A Distinct Small RNA Pathway Silences Selfish Genetic Elements in the Germline. Science, 2006. 313(5785): p. 320-324. peixe cebra,Houwing, S., et al., A Role for Piwi and piRNAs in Germ Cell Maintenance and Transposon Silencing in Zebrafish. Cell, 2007. 129(1): p. 69-82. ratoKirino, Y. and Z. Mourelatos, Mouse Piwi-interacting RNAs are 2[prime]-O-methylated at their 3[prime] termini. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(4): p. 347-348. e rata. Esta modificación no extremo 3’ é unha 2’-O-metilación; a razón de que exista esta modificación non está clara, pero suxeriuse que incrementa a estabilidade do piRNA.Faehnle, C.R. and L. Joshua-Tor, Argonautes confront new small RNAs. Current Opinion in Chemical Biology, 2007. 11(5): p. 569-577. Pénsase que hai centos de miles de moléculas diferentes de piRNA entre os mamíferos.Das, P.P., et al., Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Molecular Cell, 2008. 31(1): p. 79-90. Ata o momento, descubríronse unhas 50 000 secuencias distintas de piRNA no rato e máis de 13 000 en D. melanogaster.Lin, H., et al., The role of the piRNA pathway in stem cell self-renewal. Developmental Biology, 2008. 319(2): p. 479-479.
Todos os piRNAs presentan en común o feito de que carecen de secuencias xenómicas veciñas para formar unha forquita. Por esa razón, en todas as especies os piRNAs deben orixinarse a partir dun tipo diferente de precursor do que teñen os microARN. Os rasiRNA de Drosophila poden considerarse un subgrupo dentro dos piRNA, e como ocorre en C. elegans, en Drosophila tamén se demostrou xeneticamente a importancia de Piwi para o silenciamento dos transposóns. Por outro lado, ratos mutantes para Mili ou Miwi (dúas proteínas de rato homólogas de Piwi) presentan maior mobilidade dos elementos transpoñibles, o que suxire que os piRNAs de rato tamén están asociados ao control dos transposóns.
Porén, non todos os piRNA son homólogos de secuencias repetidas e transposóns: en ratos e ratas, a proporción de secuencias repetidas no xenoma é do 40%, pero as repeticións representan só o 17% de todos os piRNAs, mentres que unha distribución ao chou debería xerar un 40% de secuencias repetidas entre os piRNA.
Unha característica común a todos os piRNAs (e que os diferencia dos microARN) é que derivan dun número limitado de “puntos quentes” no xenoma. Esta capacidade de xerar piRNAs está conservada en rexións sinténicas (en xenética clásica, o concepto de sintenia describe a co-localización física de loci no mesmo cromosoma dentro dun individuo ou especie; o concepto está relacionado co de ligamento xenético) – por exemplo, entre o rato e a rata – pero as secuencias específicas dos piRNAs non están conservadas. Quizais os puntos quentes están asociados con estruturas específicas da cromatina, ou son necesarios para xerar ditas estruturas, e a súa importancia pode ir alén da produción de piRNAs. En Drosophila, este agrupamento define loci reguladores mestres para o control de transposóns. Por exemplo, o locus flamenco (que controla a expansión de "gypsy" e outros elementos móbiles) exerce a súa función desenvolvendo unha resposta de piRNAs contra esas secuencias. Brennecke e colaboradores propuxeron que os loci reguladores mestres representan un sitio para a memoria xenética dos transposóns en moscas. Non obstante, non está claro por que a produción de piRNAs necesita estar concentrada en rexións específicas.
Asociación coas proteínas piwi En xeral, os ARN pequenos que funcionan na interferencia (RNAi) asócianse a proteínas da familia "Argonauta", formando o complexo RISC (RNA-induced silencing complex). Neste complexo, a proteína Argonauta exerce a actividade bioquímica que corta o ARNm diana e interacciona con outras proteínas, mentres que o ARN pequeno confire a especificidade de substrato, a través da complementariedade da súa secuencia. As proteínas Argonauta comparten un dominio PAZ (Piwi, Argonauta, Zille) e un dominio Piwi característicos, e de acordo coa súa secuencia pódense agrupar en tres subfamilias: a subfamilia Argonauta a subfamilia Piwi unha tercera subfamilia, específica de Caenorhabditis elegans No caso de Drosophila, identificáronse 5 proteínas Argonauta: Ago1 e Ago2 pertencen á subfamilia Argonauta e están implicadas no silenciamento postranscricional; as proteínas da subfamilia Argonauta exprésanse en moitos tecidos somáticos. Ago3, Aubergine (Aub) e Piwi representan a subfamilia Piwi; as proteínas da subfamilia Piwi exprésanse fundamentalmente na liña xerminal (aínda que se definiron algunhas funcións somáticas).
Varios estudos demostraron que as proteínas da subfamilia Piwi asócianse a unha poboación diferenciada de ARN pequenos en Drosophila, ratos, ratas e peixes cebra , que son os piRNA.
Localización Os piRNA atópanse en clústeres por todo o xenoma; estes clústeres poden conter desde só dez a ata moitos milleiros de piRNAsO'Donnell, K.A. and J.D. Boeke, Mighty Piwis Defend the Germline against Genome Intruders. Cell, 2007. 129(1): p. 37-44. e poden variar en tamaño desde 1 kb a 100 kb. Aínda que a agrupación en clústeres dos piRNA está moi conservada entre especies, a secuencia non.Malone, C.D. and G.J. Hannon, Small RNAs as Guardians of the Genome. Cell, 2009. 136(4): p. 656-668. En Drosophila melanogaster e vertebrados os piRNAs foron localizados en areas que carecen de xenes codificantes de proteínas,Brennecke, J., et al., An Epigenetic Role for Maternally Inherited piRNAs in Transposon Silencing. Science, 2008. 322(5906): p. 1387-1392. pero en C. elegans foron localizados entre xenes que codifican proteínas.
En mamíferos os piRNA atópanse tanto nos testículosAravin, A., et al., A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature, 2006. 442(7099): p. 203-207. coma nos ovarios Tam, O. H. et al. Pseudogene-derived small interfering RNAs regulate gene expression in mouse oocytes. Nature 453, 534–538 (2008)., aínda que parece que só se requiren nos machos . En invertebrados os piRNAs foron detectados na liña xerminal tanto de machos coma de femias .
A nivel celular os piRNA foron atopados tanto no núcleo celular coma no citoplasma, o que suxire que as vías do piRNA poden funcionar en ambas as dúas áreas e, xa que logo, poden ter múltiples efectosRuvkun, G., Tiny RNA: Where do we come from? What are we? Where are we going? Trends in Plant Science, 2008. 13(7): p. 313-316..
Bioxénese A bioxénese dos piRNA non se comprende aínda totalmente, pero propuxéronse varios posibles mecanismos. Os piRNA mostran a tendencia característica de derivar só dunha cadea de ADN, e isto pode indicar que son o produto dunha molécula precursora longa monocatenaria. Suxeriuse unha vía primaria de procesamento, que é a única que se usa para producir os piRNA do paquiteno da meiose; neste mecanismo, os precursores dos piRNA transcríbense orixinando piRNA cunha tendencia a unirse a uridinas en 5'Aravin , A.A., et al., A piRNA Pathway Primed by Individual Transposons Is Linked to De Novo DNA Methylation in Mice. Molecular Cell, 2008. 31(6): p. 785-799.Brennecke, J., et al., Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila. Cell, 2007. 128(6): p. 1089-1103.. Tamén se propuxo un mecanismo "Ping Pong" no que os piRNA primarios recoñecen as súas dianas complementarias e causan o recrutamento de proteínas piwi. Isto ten como resultado o corte do transcrito nun punto situado a dez nucleótidos do extemo 5’ do piRNA primario, producindo o piRNA secundario. Estes piRNA secundarios teñen como dianas secuencias que posúen unha adenina na décima posición. Dado que o piRNA implicado no ciclo ping pong dirixe os seus ataques a transcritos de transposóns, o ciclo ping pong actúa só ao nivel transcricional. Algún destes mecanismos ou ambos poden actuar en diferentes especies; C. elegans, por exemplo, ten piRNA, pero non parece usar o mecanismo ping pong en absoluto.
Un número significativo dos piRNAs identificados en peixe cebra e D.melanogaster contén adenina na posición décima, e isto foi interpretado como unha posible evidencia dun mecanismo biosintético conservado entre especies. Indicios do mecanismo ping-pong foron identificados en animais moi primitivos como esponxas e cnidarios, o que apunta á existencia do ciclo ping-pong xa nas primeiras pólas da árbore evolutiva dos metazoos Grimson, A., Srivastava, M., Fahey, B., Woodcroft, B.J., Chiang, H.R., King, N., Degnan, B.M., Rokhsar, D.S., and Bartel, D.P. (2008). Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals. Nature 455, 1193–1197..
Función A ampla variación entre especies nas secuencias dos piRNA e na función das proteínas piwi contribúe á dificultade de establecer a funcionalidade dos piRNAWang, G. and V. Reinke, A C. elegans Piwi, PRG-1, Regulates 21U-RNAs during Spermatogenesis. Current Biology, 2008. 18(12): p. 861-867.. Porén, como ocorre con outros ARN pequenos, pénsase que os piRNAs están implicados no silenciamento de xenes, especificamente o silenciamento de transposóns. A maioría dos piRNA son moléculas antisentido con respecto a secuencias de transposón, o que suxire que os transposóns son as dianas dos piRNA. Nos mamíferos parece que a actividade dos piRNA no silenciamento de transposóns é máis importante durante o desenvolvemento embrionario , e tanto en C. elegans coma en humanos, os piRNA son necesarios para a espermatoxénese.
Silenciamento de ARN