miniatura|300px|dereita|Modelo estrutural da protease do VIH (virus da SIDA) unida a un inhibidor da protease, o ritonavir. A estrutura da protease móstrase por medio de fitas vermellas, azuis e amarelas, e o inhibidor represéntase por unha estrutura de esferas e variñas preto do centro da protease. Modelo creado a partir do PDB 1HXW. miniatura|150px|dereita|Inhibición competitiva: o substrato (S) e o inhibidor (I) compiten polo sitio activo.
Os inhibidores encimáticos son moléculas que se unen a encimas e diminúen a súa actividade. Como o bloqueo dun encima pode matar un organismo patóxeno ou corrixir un desequilibrio metabólico, moitos medicamentos actúan como inhibidores encimáticos. Tamén se usan como herbicidas e pesticidas. Porén, non todas as moléculas reguladoras que se unen a encimas son inhibidores; existen os activadores encimáticos, que se unen a encimas incrementando a súa actividade.
A unión dun inhibidor pode impedir a entrada do substrato ao sitio activo do encima e/ou empecer que o encima catalice a súa reacción correspondente. A unión do inhibidor pode ser reversible ou irreversible. Normalmente, os inhibidores irreversibles reaccionan co encima de forma covalente e modifican a súa estrutura química en residuos esenciais dos aminoácidos necesarios para a actividade encimática. Ao contrario, os inhibidores reversibles únense ao encima de forma non covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibición, dependendo de se o inhibidor se une ao encima, ao complexo encima-substrato ou a ambos os dous.
Moitos medicamentos son inhibidores encimáticos, polo que o seu descubrimento e mellora é un eido de investigación moi activo en bioquímica e farmacoloxía. A validez dun inhibidor encimático medicinal adoita vir determinada pola súa especificidade (a súa incapacidade de unirse a outras proteínas) e a súa potencia (a súa constante de disociación, a cal indica a concentración necesaria para inhibir un encima). Unha alta especificidade e potencia asegura que o medicamento vai ter poucos efectos secundarios e, por tanto, unha baixa toxicidade.
Os inhibidores encimáticos tamén se usan na natureza e están implicados na regulación do metabolismo. Por exemplo, os encimas dunha ruta metabólica poden ser inhibidos polos produtos resultantes das súas respectivas rutas. Este tipo de retroalimentación negativa retarda o fluxo a través da ruta cando os produtos comezan a acumularse e é unha maneira importante de manter a homeostase nunha célula. Outros inhibidores encimáticos celulares son proteínas que se unen especificamente e inhiben unha diana encimática. Isto pode axudar a controlar encimas que poden ser daniños para a célula, como as proteases ou nucleases. Un bo exemplo é o inhibidor da ribonuclease, que se une a este encima nunha das interaccións proteína-proteína máis fortes coñecidas.Shapiro R, Vallee BL. Interaction of human placental ribonuclease with placental ribonuclease inhibitor. Biochemistry. 1991 Feb 26;30(8):2246–55. (en inglés) PMID 1998683 Como inhibidores encimáticos naturais tamén hai que salientar os velenos, que son usados como defensa contra os depredadores ou como forma de matar unha presa.
Clases estruturais de inhibidores Os inhibidores encimáticos son un conxunto de substancias quimicamente diversas que en tamaño van desde pequenas moléculas orgánicas a proteínas macromoleculares.
Entre os inhibidores que son pequenas moléculas están metabolitos primarios esenciais que inhiben encimas de augas arriba da vía metabólica que producía ditos metabolitos. Isto proporciona un bucle de retroalimentación negativa que impide a sobreprodución de metabolitos e así mantén a homeostase celular (condicións internas estables). Outras pequenas moléculas son metabolitos secundarios, que non son esenciais para o organismo, pero que lle proporcionan unha vantaxe evolutiva, por exemplo porque se usan para repeler predadores ou competir con outros organismos ou inmobilizar as presas. Ademais, moitos fármacos son pequenas moléculas inhibidoras de encimas que afectan encimas que modifican as doenzas do paciente ou de encimas de patóxenos que estes necesitan para o seu crecemento e reprodución.
Ademais das pequenas moléculas, algunhas proteínas actúan como inhibidores encimáticos. Os exemplos máis salientables son as serpinas (inhibidores da serina protease, en inglés serine protease inhibitors) que producen os animais para protexerse contra a activación inapropiada de encimas e polas plantas para previr a predación polos herbívoros. Outra calse de proteínas inhibidoras son os inhibidores da ribonuclease, que se unen ás ribonucleases nunha das interaccións proteína-proteína máis forte coñecida. Un caso especial de inhibidor encimático proteico son os cimóxenos, que conteñen un péptido N-terminal autoinhibitorio que se une ao sitio activo do encima que bloquea intramolecularmente a súa actividade como mecanismo protector contra a catálise incontrolada. O péptido N-terminal é cortado e separado do encima precursor do cimóxeno por outro encima para liberar así o encima activo.
O sitio de unión dos inhibidores nos encimas é normalmente o mesmo sitio onde se une o substrato. Estes inhibidores de sitio activo coñécense como ortostéricos (orientación "regular"). O mecanismo da inhibición ortostérica é simplemente impedir que se una o substrato ao encima por competición directa, o cal á súa vez impide que o encima catalice a conversión dos substratos en produtos. Alternativamente, o inhibidor pode unirse a un sitio afastado do sitio activo, e estes inhibidores coñécense como alostéricos (orientación "alternativa"). Os mecanismos da inhibición alostérica son variados e entre eles están cambiar a conformación (forma) do encima de maneira que xa non poida unirse o substrato (cineticamente indistinguible da inhibición ortostérica competitiva) ou alternativamente estabilizar a unión do substrato ao encima pero bloquear o encima nunha conformación que xa non é cataliticamente activa.
Inhibidores reversibles
Os inhibidores reversibles únense aos encimas por medio de interaccións non covalentes tales como as pontes de hidróxeno, as interaccións hidrofóbicas e os enlaces iónicos. Os enlaces febles múltiples entre o inhibidor e o sitio activo combínanse para producir unha unión forte e específica. Ao contrario do que ocorre co substrato e os inhibidores irreversibles, os inhibidores reversibles xeralmente non experimentan reaccións químicas cando se unen ao encima e poden ser eliminados doadamente por dilución ou por diálise.
Tipos de inhibidores reversibles
A diferenza dos inhibidores irreversibles, os inhibidores reversibles xeralmente non experimentan reaccións químicas cando se unen ao encima e poden ser retirados facilmente por dilución ou diálise. Un caso especial é o dos inhibidores reversibles covalentes que forman un enlace químico co encima, pero o enlace pode ser desfeito, de tal xeito que a inhibición é totalmente reversible.
Os inhibidores reversibles clasifícanse en catro tipos segundo a clasificación de Cleland introducida en 1963. Clasifícanse de acordo co efecto do inhibidor sobre a Vmax (velocidade máxima da reacción catalizada polo encima) e a Km (a concentración de substrato na que a actividade do encima é a metade da máxima) a medida que se varía a concentración do substrato do encima. Poden ser:
Competitivos. Na inhibición competitiva, o substrato e o inhibidor non se poden unir ao mesmo encima ao mesmo tempo, como se mostra na figura da dereita. Isto xeralmente ocorre porque o inhibidor e o substrato teñen unha estrutura similar e ambos os dous teñen afinidade polo sitio activo, e o substrato e o inhibidor compiten para entrar nel. Este tipo de inhibición pódese superar con concentracións suficientemente altas de substrato, que deixan fóra de competición ao inhibidor. O cambio nas concentracións de inhibidor fan cambiar a Km pero non a Vmax Acompetitivos. A inhibición acompetitiva ou incompetitiva (uncompetitive inhibition) prodúcese cando o inhibidor se une só ao complexo encima-substrato, non ao encima libre, é dicir, se non está unido o substrato, o inhibidor non se pode unir. O complexo EIS é cataliticamente inactivo. Esta forma de inhibición é rara e causa unha diminución tanto no valor de Vmax coma no de Km. Non hai que confundila coa inhibición non-competitiva (non-competitive inhibition). Non-competitivos. Na inhibición non-competitiva a unión do inhibidor ao encima reduce a súa actividade, pero non afecta a unión do substrato. Este tipo de inhibidor únese con igual afinidade ao encima libre (E) que ao complexo encima-substrato (ES). Pode dicirse que ten as capacidades dos inhibidores competitivos e acompetitivos, pero sen mostrar ningunha preferencia por un dos tipos. Como consecuencia, a amplitude da inhibición depende soamente da concentración do inhibidor. A Vmax diminuirá debido á incapacidade de que a reacción proceda eficientemente, pero a Km permanecerá igual, xa que a unión do substrato, por deficnición, aínda funcionará adecuadamente. Mixtos. Na inhibición mixta o inhibitor pode unirse ao encima tanto se o substrato está xa unido como se non. Por tanto, a inhibición mixta é unha combinación de inhibición competitiva e non-competitiva. Ademais, a afinidade do inhibidor polo encima libre e o complexo encima substrato poden diferir. Ao incrementar as concentracións de substrato [S], este tipo de inhibición pode reducirse (debido á contribución competitiva), pero non se suprime totalmente (debido ao compoñente non-competitivo). Aínda que é posible que os inhibidores de tipo mixto se unan ao sitio activo, este tipo de inhibición xeralmente resulta dun efecto alostérico no cal o inhibidor se une a un sitio diferente do encima (sitio alostérico). A unión do inhibidor a ese sitio alostérico cambia a conformación do encima (é dicir, a estrutura terciaria ou forma tridimensional) de tal xeito que se reduce a afinidade do substrato polo sitio activo.
Estes catro tipos de inhibición poden tamén distinguirse polo efecto de incrementar a concentración de substrato ([S]) no grao de inhibición causada por unha determinada cantidade de inhibidor. Para a inhibición competitiva o grao de inhibición redúcese ao incrementar a [S], para a inhibición non-competitiva o grao de inhibición non cambia, e para a acompetitiva (tamén chamada incompetitiva ou anticompetitiva) o grao de inhibición increméntase coa [S].
Descrición cuantitativa da inhibición reversible A inhibición reversible pode ser descrita cuantitativamente en termos da unión do inhibidor ao encima e ao complexo encima-substrato, e os seus efectos nas constantes cinéticas do encima. No esquema clásico de Michaelis-Menten mostrado abaixo, un encima (E) únese ao seu substrato (S) para formar o complexo encima-substrato (ES). Na catálise, este complexo rompe para liberar o produto (P) e o encima (E). O inhibidor (I) pode unirse tanto a (E) coma a (ES) coas constantes de disociación Ki ou Ki', respectivamente. Os inhibidores competitivos pódense unir a (E), pero non a (ES). A inhibición competitiva aumenta o valor de Km (é dicir, o inhibidor interfire coa unión do substrato), mais non afecta á Vmax (o inhibidor non interfire a catálise en (ES) porque non se pode unir a (ES)).* Irwin H. Segel, Enzyme Kinetics : Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. Wiley–Interscience; New edition (1993), (en inglés) ISBN 0-471-30309-7 Os inhibidores acompetitivos ou incompetitivos únense a ES. Nesta inhibición diminúe tanto Km coma Vmax. O inhibidor afecta a unión do substrato ao incrementar a afinidade do encima polo substrato (diminuíndo a Km) así como dificultando a catálise (decrece a Vmax). Os inhibidores non-competitivos teñen afinidades idénticas por (E) e (ES) (Ki = Ki'). A inhibición non-competitiva non cambia a Km (non afecta á unión do substrato) pero diminúe a Vmax (a unión do inhibidor interfire a catálise).