thumb|334px|Espectrofotômetro O espectrofotômetro é um instrumento de análise, amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa, capaz de medir e comparar a quantidade de luz (radiação eletromagnética) absorvida, transmitida ou refletida por uma determinada amostra, seja ela solução, sólido transparente ou sólido opaco. Existem duas classes de espectrofotômetros: o de feixe simples e o de duplo feixe e eles são constituídos, essencialmente, por cinco componentes principais: as fontes de radiação, o monocromador, o porta-amostras, os detectores e o indicador de sinal.Webster, John G. "The Measurement, Instrumentation and Sensors handbook". CRC Press LLC, 1999.
O resultado da espectrofotometria é dado por um gráfico que é conhecido como espectro e fornece informações de intensidade por comprimento de onda da fonte de luz. Essa faixa de comprimentos de onda desejados pode ser selecionada antes da realização das medidas, o que torna a medida mais específica e eficaz já que não será necessário um número excessivo de dados para obter o resultado esperado. Os espectrofotômetros mais sofisticados cobrem uma gama de luz entre 200 nm e 2500 nm (ultravioleta a infravermelho)."Spectrophotometry", http://www.nist.gov/pml/div685/grp03/spectrophotometry.cfm, página visitada em 04/05/2014. A faixa de comprimentos de onda da radiação eletromagnética mais utilizada está, aproximadamente, entre 350 nm e 750 nm, ou seja, no espectro de luz visível. Para que os resultados obtidos pelas medidas realizadas no espectrofotômetro sejam precisos, é necessário sempre fazer a calibração do instrumento utilizando padrões conhecidos.
História thumb|180px|Arnold Beckman, 1921 thumb|220px|Espectrofotômetro DU, 1941
O primeiro espectrofotômetro foi inventado em 1940, pelo químico americano Arnold O. Beckman (1900 - 2004) e seus colegas dos Laboratórios de Tecnologias Nacionais, na empresa Beckman Coulter Inc., fundada em 1935. O líder do projeto foi o engenheiro americano Howard Cary (1908 - 1991). O espectrofotômetro foi a maior descoberta da empresa.
Antes de 1940, o processo de análise química era muito longo e trabalhoso levando semanas para ser concluído, com uma precisão de apenas 25%, de acordo com o MIT. Em 1940, quando o Espectrofotômetro DU foi introduzido, o processo ficou bem mais simples e rápido, necessitando de apenas alguns minutos para a análise. De acordo com a mesma fonte, a precisão desse instrumento era de 99,99%. A partir de então, esse espectrofotômetro se tornou o instrumento padrão para análises químicas.
No início, existiam problemas de desempenho do espectrofotômetro. Esses problemas levaram a mudanças no projeto. O espectrofotômetro modelo B usava um prisma de quartzo ao invés de um prisma de vidro, melhorando as capacidades UV do dispositivo. O modelo C, logo em seguida, trouxe mudanças que aumentaram a resolução de comprimentos de onda no UV e dessa forma três espectrofotômetros modelo C foram construídos. Em 1941, o modelo D, também conhecido como modelo DU, foi produzido com uma lâmpada de hidrogênio e outros tipos de melhorias. Esse projeto permaneceu essencialmente inalterado entre 1941 e 1976, quando foi interrompido. Até 1976, mais de 30.000 modelos DU e DU-2 tinham sido vendidos. Esses instrumentos foram utilizados em clínicas, laboratórios industriais e na química e bioquímica.
Em 1981, a empresa Cecil Instruments produziu um espectrofotômetro controlado por um microprocessador, tornando-o um dispositivo automatizado e mais rápido. Entre 1984 e 1985, foram desenvolvidas versões de espectrofotômetros de duplo feixe. Com a década de 1990, veio a adição de softwares externos, controlados pelo computador, que exibiam na tela os espectros resultantes. Hoje, o aperfeiçoamento dos espectrofotômetros continua e suas aplicações vão desde a ciência e a medicina até a investigação de cenas de crime. "The History of Spectrophotometry", http://www.ehow.com/about_6595173_history-spectrophotometry.html, página visitada em 04/05/2014.
Embora novos modelos tenham sido introduzidos ao longo dos anos, ainda existem muitos espectrofotômetros modelo DU em uso ao redor do mundo. As contribuições extraordinárias de Beckman levaram o presidente George H. W. Bush a dar-lhe a Medalha Nacional de Ciência, em 1989, por sua liderança em desenvolvimento de instrumentação analítica e por sua profunda preocupação com a vitalidade das empresas científicas do país. "Arnold O. Beckman", http://www.beckman-foundation.com/aoblongbi.html, página visitada em 04/05/2014.
Princípios físicos Alguns princípios físicos são importantes para entender o funcionamento dos espectrofotômetros.
Lei de Bragg A Lei de Bragg ou Lei de Difração foi explicada pelo físico australiano William Lawrence Bragg, em 1912. Embora simples, a lei confirmou que existem partículas reais na escala atômica e forneceu uma nova ferramenta para o estudo de cristais utilizando difração de raios X. thumb|Modelo de Bragg em duas dimensões: A diferença de caminho óptico entre os dois raios é , onde é a distância entre os planos considerados e , o ângulo de incidência. |alt=Modelo de Bragg em duas dimensões|direita|x125px A difração depende de dois fatores: da estrutura do material e do comprimento de onda utilizado. Então, supõe-se que as ondas incidentes sofrem reflexão especular em planos paralelos de átomos de um cristal, onde cada plano reflete apenas uma porcentagem da radiação. Na reflexão especular, o ângulo de reflexão é igual ao ângulo de incidência (Lei da Reflexão). Embora a reflexão de cada plano seja especular, existem apenas alguns valores para o ângulo de incidência em que as reflexões se somam em fase resultando em um feixe difratado intenso. Nas direções em que as reflexões de planos paralelos de átomos interferem construtivamente, ou seja, nos máximos de intensidade, são observados os feixes difratados. Devemos considerar que o espalhamento é elástico, caso em que a energia inicial é conservada.Kittel, Charles. Introdução à Física do Estado Sólido. ed. LTC. 8ª ed., 2006.
Tomando uma família de planos paralelos separados por uma distância , a diferença de caminho entre os raios refletidos por planos vizinhos é , onde é o ângulo de incidência. Essa diferença é a mesma para qualquer par de planos vizinhos pertencentes àquela família.Halliday, David; Walker, Jearl; Resnick, Robert. Fundamentos de Física: Óptica e Física Moderna. Vol. 4. ed. LTC. 8ªed., 2009. Assim, para que a intensidade da difração seja máxima, a diferença de percurso deve ser igual a um número inteiro de comprimentos de onda , ou seja, quando:
Esta é a definição da lei de Bragg e é satisfeita apenas quando .
Lei de Snell thumb|Refração da luz na interface entre dois diferentes índices de refração, com .|x200px A Lei de Snell ou Segunda Lei da Refração foi formulada pelo matemático holandês Willebrord Snellius, em 1621. Ela fornece o desvio angular sofrido por um raio de luz após passar de um meio para outro que tenha um índice de refração diferente. Nesta mudança de meios, a frequência da onda não é alterada, embora a velocidade e o comprimento de onda sejam. A lei é dada pela seguinte expressão:
onde o índice de refração é expresso por: . = velocidade da luz no vácuo; = velocidade no meio escolhido; = índice de refração no meio escolhido.
A lei de Snell também pode ser escrita como:
já que .
Funcionamento e partes do espectrofotômetro O funcionamento dos espectrofotômetros é muito simples. A fonte de radiação emite luz (UV, visível ou IR) e essa luz é fracionada pelo monocromador (prisma ou rede de difração) nos comprimentos de onda que a compõem, ou seja, ela sofre refração. A faixa de comprimentos de onda, inicialmente selecionada, é dirigida para a amostra (soluções, filmes finos, pós). Parte dessa luz é absorvida e parte é transmitida. A luz que é transmitida chega ao detector e lá é transformada em um sinal elétrico. Finalmente, o sinal elétrico é recebido pelo computador que transmite esses dados em forma de espectro (absorção x comprimento de onda). "Espectrofotometria", http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/componentes.html, página visitada em 09/05/2014.
Como citado anteriormente, os espectrofotômetros são compostos basicamente por cinco partes: a fonte de radiação, o monocromador, o porta-amostras, os detectores e o indicador de sinal. Existem diversos tipos de cada componente de um espectrofotômetro. Abaixo estão listados alguns deles.
Fontes de radiação Lâmpada de filamento de Tungstênio: é uma fonte de radiação que emite no visível e no infravermelho próximo, ou seja, produz uma radiação útil para o funcionamento do espectrofotômetro na faixa de 320 a 2500 nm. A lâmpada opera em uma temperatura de 3000 K.
Lâmpada de descarga de Deutério: é uma fonte de radiação que emite no ultravioleta (UV), ou seja, produz radiação útil para o espectrofotômetro na faixa de 200 a 400 nm. Nessa lâmpada os elétrons são excitados por uma descarga e quando voltam para seus estados fundamentais, emitem a radiação.
Lâmpada de vapor de Mercúrio: é uma fonte de radiação que emite no visível e no ultravioleta, ou seja, produz uma radiação útil para o espectrofotômetro na faixa de 300 a 600 nm.Lothian, G.F. Absorption Spectrophotometry. ed. Adam Hilger LTD. 3ªed., 1969.
Monocromadores Prisma: É um elemento óptico transparente com superfícies lisas e polidas capaz de refratar a luz incidente. Os prismas podem ser usados para refletir a luz ou para dividir a luz branca policromática em sete componentes monocromáticas do espectro visível. Redes de Difração: É um componente óptico com uma estrutura periódica que divide e difrata a luz em vários feixes que viajam em diferentes direções. As redes de difração possuem uma resolução melhor do que os prismas e podem ser utilizadas em todas as regiões espectrais.
Compartimentos para amostras Cubetas: Para amostras líquidas, o recipiente utilizado é a cubeta retangular de vidro ou de quartzo. A cubeta ideal para medidas, realizadas em espectrofotômetros, é aquela cuja aresta da base tem um tamanho de 1 cm. Esses recipientes devem ser de materiais diferentes dependendo da região de análise. Caso a medida seja feita na região do visível, então a cubeta deve ser de vidro. Porém, se a região de análise for a do ultravioleta, então a cubeta deve ser de quartzo, já que o vidro absorve a radiação ultravioleta.
Detectores Tubo Fotomultiplicador: É um dispositivo elétrico que converte a luz em sinal elétrico. São detectores extremamente sensíveis nas regiões do ultravioleta, visível e infravermelho próximo. Esse detector multiplica a corrente produzida pela incidência de luz em até 100 milhões de vezes. CCD (Dispositivo de carga acoplada): São detectores baseados em silício e consistem em uma matriz densa de fotodiodos que convertem a energia dos fótons incidentes em elétrons.
Indicador de sinal Computador: É o dispositivo de processamento de dados utilizado. Nele são instalados softwares apropriados que fornecem o resultado das medidas realizadas no espectrofotômetro.
Tipos de espectrofotômetros Existem duas classes de espectrofotômetros: o de feixe simples e o de duplo feixe.Skoog, Douglas A.; Holler, F. James; Crouch, Stanley. Principles of instrumental analysis. ed. Thomson. 6ªed., 1998.
Espectrofotômetro de feixe simples
O espectrofotômetro de feixe simples foi o primeiro tipo de espectrofotômetro inventado, em 1940. Essa classe do instrumento consiste em que toda a radiação fornecida pela fonte de emissão atravesse a amostra, ou seja, a intensidade relativa de luz é medida antes e depois da amostra de teste ser inserida. Assim, para a realização das medidas basta colocar a amostra no compartimento adequado, previamente determinado pelo fabricante, e fazer com que a radiação passe por essa amostra. Esse tipo de equipamento tem um custo acessível, já que é formado por um sistema não muito complexo.
Espectrofotômetro de duplo feixe