Espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear de l'àcids nucleic, (RMN d'àcid nucleic) és l'ús de l'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear per obtenir informació sobre l'estructura i la dinàmica de les molècules d'àcids nucleics, com l'ADN o l'ARN. És útil per a molècules de fins a 100 nucleòtids i, a partir del 2003, gairebé la meitat de totes les estructures d'ARN conegudes havien estat determinades per espectroscòpia de RMN.

La RMN té avantatges respecte a la cristal·lografia de raigs X, que és l'altre mètode per a la determinació de l'estructura dels àcids nucleics d'alta resolució, ja que les molècules s'observen en el seu estat natural de solució en lloc d'en una xarxa cristal·lina que pot afectar les propietats estructurals de la molècula. També és possible investigar la dinàmica amb RMN. Això té com a cost unes estructures lleugerament menys precises i detallades que la cristal·lografia.

La RMN d'àcids nucleics utilitza tècniques similars a les de la RMN de proteïnes, però té diverses diferències. Els àcids nucleics tenen un percentatge menor d'àtoms d'hidrogen, que són els àtoms que s'observen habitualment en la RMN, i com que les dobles hèlixs d'àcids nucleics són rígides i aproximadament lineals, no es pleguen sobre si mateixes per donar correlacions de "llarg abast". Els àcids nucleics també tendeixen a tenir ressonàncies distribuïdes en un rang més petit que les proteïnes, cosa que fa que els espectres siguin potencialment més densos i difícils d'interpretar.

Mètodes experimentals Els mètodes de RMN bidimensionals gairebé sempre s'utilitzen amb àcids nucleics. Aquestes inclouen l'espectroscòpia de correlació (COSY) i l'espectroscòpia de transferència de coherència total (TOCSY) per detectar acoblaments nuclears a través d'enllaços, i l'espectroscòpia d'efecte nuclear Overhauser (NOESY) per detectar acoblaments entre nuclis que són propers entre si a l'espai. Els tipus de RMN que es fan habitualment amb àcids nucleics són RMN de 1H, RMN de 13C, RMN de 15N i RMN de 31P. La RMN de 19F també és útil si s'incorporen nucleòtids no naturals com la 2'-fluoro-2'-desoxiadenosina a la cadena d'àcid nucleic, ja que els àcids nucleics naturals no contenen cap àtom de fluor.

1H i 31P tenen una abundància natural propera al 100%, mentre que 13C i 15N tenen abundàncies naturals baixes. Per a aquests dos últims nuclis, hi ha la capacitat d'enriquir isotòpicament els àtoms desitjats dins de les molècules, ja sigui uniformement o de manera específica del lloc. Els nucleòtids uniformement enriquits en 13C i/o 15N es poden obtenir mitjançant mètodes bioquímics, realitzant una reacció en cadena de la polimerasa o transcripció in vitro utilitzant dNTP o NTP derivats de bacteris cultivats en un entorn isotòpicament enriquit. L'enriquiment d'isòtops específics del lloc s'ha de fer mitjançant la síntesi química del monòmer de fosforamidita nucleòsida marcat i de la cadena completa; tanmateix, aquests són difícils i cars de sintetitzar.

Com que els àcids nucleics tenen un nombre relativament gran de protons que són intercanviables amb dissolvent, la RMN d'àcids nucleics generalment no es fa en dissolvent D2O com és habitual amb altres tipus de RMN. Això és degut a que el deuteri del dissolvent substituiria els protons intercanviables i extingiria el seu senyal. L'H₂O s'utilitza com a dissolvent, i s'utilitzen altres mètodes per eliminar el senyal fort del dissolvent, com ara saturar el senyal del dissolvent abans de la seqüència de polsos normal ("presaturació"), que funciona millor a baixa temperatura per evitar l'intercanvi dels protons saturats del dissolvent amb els protons de l'àcid nucleic; o excitar només les ressonàncies d'interès ("excitació selectiva"), que té l'efecte addicional, potencialment no desitjat, de distorsionar les amplituds màximes.

Determinació de l'estructura Els protons intercanviables i no intercanviables normalment s'assignen als seus pics específics com a dos grups independents. Per als protons intercanviables, que són en la seva major part els protons implicats en l'aparellament de bases, NOESY es pot utilitzar per trobar correlacions a través de l'espai entre bases veïnes, permetent assignar una molècula dúplex sencera mitjançant un recorregut seqüencial. Per a protons no intercanviables, molts dels quals es troben a la fracció de sucre de l'àcid nucleic, COSY i TOCSY s'utilitzen per identificar sistemes de nuclis acoblats, mentre que NOESY s'utilitza de nou per correlacionar el sucre amb la base i cada base amb la seva base veïna. Per als protons no intercanviables de l'ADN dúplex, els protons H6/H8 de la base es correlacionen amb els seus homòlegs de les bases veïnes i amb el protó H1' del sucre, permetent la caminada seqüencial. Per a l'ARN, les diferències en l'estructura química i la geometria de l'hèlix fan que aquesta assignació sigui tècnicament més difícil, però encara possible. La metodologia de caminada seqüencial no és possible per a estructures d'àcid nucleic que no siguin de doble hèlix, ni per a la forma Z-DNA, cosa que dificulta l'assignació de ressonàncies.

Els paràmetres extrets de l'espectre, principalment els pics creuats de NOESY i les constants d'acoblament, es poden utilitzar per determinar característiques estructurals locals com ara angles d'enllaç glicosídic, angles diedres (utilitzant l'equació de Karplus) i conformacions de pucker de sucre. La presència o absència de ressonàncies de protons imino, o d'acoblament entre àtoms de 15 N a través d'un enllaç d'hidrogen, indica la presència o absència d'aparellament de bases. Per a estructures a gran escala, aquests paràmetres locals s'han de complementar amb altres supòsits o models estructurals, perquè els errors s'acumulen a mesura que es recorre la doble hèlix i, a diferència de les proteïnes, la doble hèlix no té un interior compacte i no es plega sobre si mateixa. Tanmateix, es pot obtenir informació d'orientació a llarg termini mitjançant experiments d'acoblament dipolar residual en un medi que imposa un alineament feble a les molècules d'àcid nucleic.

Recentment, s'ha introduït la metodologia de RMN d'estat sòlid per a la determinació de l'estructura dels àcids nucleics. El protocol implica dos enfocaments: l'etiquetatge selectiu de tipus nucleòtid de l'ARN i l'ús d'experiments de correlació heteronuclear.

La RMN també és útil per investigar geometries no estàndard com ara hèlixs corbes, aparellament de bases que no són de Watson-Crick i apilament coaxial. Ha estat especialment útil per sondejar l'estructura dels oligonucleòtids d'ARN naturals, que tendeixen a adoptar conformacions complexes com ara bucles de tija i pseudonusos. Les interaccions entre l'ARN i els ions metàl·lics es poden estudiar mitjançant diversos mètodes, com ara l'observació dels canvis en el desplaçament químic després de la unió d'ions, l'observació de l'eixamplament de línies per a espècies d'ions paramagnètics i l'observació dels contactes NOE intermoleculars per a imitacions organometàl·liques dels ions metàl·lics. La RMN també és útil per estudiar la unió de molècules d'àcid nucleic a altres molècules, com ara proteïnes o fàrmacs. Això es pot fer mitjançant el mapatge de desplaçament químic, que consisteix a veure quines ressonàncies es desplacen en unir-se l'altra molècula, o mitjançant experiments de saturació creuada on una de les molècules d'unió està selectivament saturada i, si s'uneix, la saturació es transfereix a l'altra molècula del complex.

Les propietats dinàmiques com ara els equilibris dúplex-monocatenari i les taxes d'unió d'altres molècules als dúplex també es poden determinar pel seu efecte sobre el temps de relaxació espín-xarxa T1, però aquests mètodes són insensibles a les taxes intermèdies de 104-108 s−1, que s'han d'investigar amb altres mètodes com la RMN d'estat sòlid. La dinàmica de les propietats mecàniques d'una doble hèlix d'àcid nucleic, com ara la flexió i la torsió, també es pot estudiar mitjançant RMN. Els experiments de RMN de gradient de camp pulsat es poden utilitzar per mesurar constants de difusió.

Història Els estudis de RMN d'àcids nucleics es van dur a terme ja el 1971 i es van centrar en l'ús de les ressonàncies de protons imino de baix camp per investigar les interaccions d'aparellament de bases. Aquests primers estudis es van centrar en l'ARNt perquè aquests àcids nucleics eren les úniques mostres disponibles en aquell moment amb un pes molecular prou baix com per fer que les amplades de línia espectrals de RMN fossin pràctiques. L'estudi es va centrar en els protons de camp baix perquè eren els únics protons que es podien observar de manera fiable en solució aquosa utilitzant els millors espectròmetres disponibles en aquell moment. Ràpidament es va adonar que els espectres dels protons imino de camp baix proporcionaven pistes sobre l'estructura terciària del tRNA en solució. El primer espectre de RMN d'un ADN de doble hèlix es va publicar el 1977 utilitzant una doble hèlix sintètica de 30 parells de bases. Per superar l'eixamplament sever de línies en l'ADN natiu, es va preparar i estudiar ADN natural degradat per obtenir informació sobre la longitud de persistència de l'ADN de doble hèlix. Al mateix temps, es van estudiar les partícules centrals del nucleosoma per obtenir més informació sobre la flexibilitat de la doble hèlix. Els primers espectres de RMN reportats per a un ADN de seqüència nativa uniforme de baix pes molecular, fet amb enzims de restricció, es van publicar el 1981. Aquest treball també va ser el primer informe d'espectres de RMN d'àcids nucleics obtinguts a camp alt. Els estudis de RMN bidimensionals van començar a publicar-se el 1982 i després, amb l'arribada de la síntesi d'oligonucleòtids i una instrumentació més sofisticada, es van publicar molts estudis estructurals detallats a partir del 1983.

Referències

Categoria:Ressonància magnètica nuclear Categoria:Àcids nucleics