thumb|right|250px|Terapia génica utilizando un vector de adenovirus . En algunos casos, el adenovirus insertará el nuevo gen en una célula. Si el tratamiento tiene éxito, el nuevo gen producirá una proteína funcional para tratar una enfermedad. La terapia génica se ha desarrollado como un método de acercamiento al tratamiento de las enfermedades humanas, basado en la transferencia de material genético a las células de un individuo.
La finalidad de esta transferencia de material genético es restablecer una función celular que estaba abolida o defectuosa, introducir una nueva función o bien interferir con una función existente. Así, las distintas estrategias de la terapia génica se basan en la combinación de tres elementos clave, el material genético a transferir, el método de transferencia y el tipo celular que incorporará dicho material genético.
Inicialmente la atención se centró en el tratamiento de las enfermedades hereditarias monogénicas, pero posteriormente la mayor parte de los ensayos clínicos (más de cuatrocientos) han abordado el tratamiento del cáncer.
La terapia génica humana es factible y puede ser útil, pero las herramientas necesitan ser perfeccionadas para que pueda llegar a formar parte del arsenal terapéutico habitual.
Aplicaciones Marcaje génico: El marcaje génico tiene como objetivo, no la curación del paciente, sino hacer un seguimiento de las células, es decir, comprobar si en un determinado sitio del cuerpo están presentes las células específicas que se han marcado. Un ejemplo de ello sería la puesta a punto de vectores para ensayos clínicos, permitiendo, por ejemplo, que en ocasiones en las que un paciente de cáncer (leucemia) y al que se le ha realizado un autotrasplante se pueda saber de donde proceden las células, si son de células trasplantadas o si son células que han sobrevivido al tratamiento.
Terapia de enfermedades monogénicas hereditarias: Se usa en aquellas enfermedades en las que no se puede realizar o no es eficiente la administración de la proteína deficitaria. Se proporciona el gen defectivo o ausente.
Terapia de enfermedades adquiridas: Entre este tipo de enfermedades la más destacada es el cáncer. Se usan distintas estrategias, como la inserción de determinados genes suicidas en las células tumorales o la inserción de antígenos tumorales para potenciar la respuesta inmune.
Tipos de terapia génica
Terapia génica somática: se realiza sobre las células somáticas de un individuo, por lo que las modificaciones que implique la terapia solo tienen lugar en dicho paciente. Terapia in vivo: la transformación celular tiene lugar dentro del paciente al que se le administra la terapia. Consiste en administrarle al paciente un gen a través de un vehículo (por ejemplo un virus), el cual debe localizar las células a infectar. El problema que presenta esta técnica es que es muy difícil conseguir que un vector localice a un único tipo de células diana. Terapia ex vivo: la transformación celular se lleva a cabo a partir de una biopsia del tejido del paciente y luego se le trasplantan las células ya transformadas. Como ocurre fuera del cuerpo del paciente, este tipo de terapia es mucho más fácil de llevar a cabo y permite un control mayor de las células infectadas. Esta técnica está casi completamente reducida a células hematopoyéticas pues son células cultivables, constituyendo así un material trasplantable. Terapia génica germinal: se realizaría sobre las células germinales del paciente, por lo que los cambios generados por los genes terapéuticos serían hereditarios. No obstante, por cuestiones éticas y jurídicas, esta clase de terapia génica no se lleva a cabo hoy en día.
Procedimiento
Aunque se han utilizado enfoques muy distintos, en la mayoría de los estudios de terapia génica, una copia del gen funcional se inserta en el genoma para compensar el defectivo. Si esta copia simplemente se introduce en el huésped, se trata de terapia génica de adición. Si tratamos, por medio de la recombinación homóloga, de eliminar la copia defectiva y cambiarla por la funcional, se trata de terapia de sustitución.
Actualmente, el tipo más común de vectores utilizados son los virus, que pueden ser genéticamente alterados para dejar de ser patógenos y portar genes de otros organismos. No obstante, existen otros tipos de vectores de origen no vírico que también han sido utilizados para ello. Así mismo, el ADN puede ser introducido en el paciente mediante métodos físicos (no biológicos) como electroporación, anticuerpos monoclonales, biobalística... Si conocemos la secuencia de ADN que resulta defectuosa en el paciente, podemos retirarla e introducir el material genético para lograr la correcta expresión del gen. Generalmente, se usan un tipo de enzimas que se denominan endonucleasas de restricción. Estas enzimas son capaces de reconocer determinados genes en función de la secuencia de aminoácidos, para posteriormente unirse a ese gen, cortarlo y, posteriormente, introducir el material genético correcto para lograr la expresión del gen. Es un proceso que puede parecer complejo, pero nada más lejos de la realidad ya que solo debemos conocer la secuencia errónea y emplear una endonucleasa de restricción que la reconozca, corte, e introduzca la secuencia génica de interés correcta.
Las células diana del paciente se infectan con el vector (en el caso de que se trate de un virus) o se transforman con el ADN a introducir. Este ADN, una vez dentro de la célula huésped, se transcribe y traduce a una proteína funcional, que va a realizar su función, y, en teoría, a corregir el defecto que causaba la enfermedad.
Una de las nuevas direcciones prometedoras es la creación de materiales activados por genes. Este enfoque combina la ingeniería de tejidos y la terapia génica. En este enfoque, un vector que codifica una proteína específica se une a un material biocompatible. Después de la implantación, el biomaterial sirve como base temporal para la formación de tejido nuevo y el vector transfecta las células del receptor para que comiencen a producir la proteína codificada en el sitio de la implantación.
Vectores en terapia génica
La gran diversidad de situaciones en las que podría aplicarse la terapia génica hace imposible la existencia de un solo tipo de vector adecuado. Sin embargo, pueden definirse las siguientes características para un "vector ideal" y adaptarlas luego a situaciones concretas:
Que sea reproducible. Que sea estable. Que permita la inserción de material genético sin límite de tamaño. Que permita la transducción tanto en células en división como en aquellas que no están proliferando. Que posibilite la integración del gen terapéutico en un sitio específico del genoma. Que se integre una vez por célula, para poder controlar la dosis. Que reconozca y actúe sobre células específicas. Que la expresión del gen terapéutico pueda ser regulada. Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune. Que pueda ser caracterizado completamente. Que sea inocuo o que sus posibles efectos secundarios sean mínimos. Que sea fácil de producir y almacenar. Que todo el proceso de su desarrollo tenga un coste razonable.
Los vectores van a contener los elementos que queramos introducir al paciente, que no van a ser solo los genes funcionales, sino también elementos necesarios para su expresión y regulación, como pueden ser promotores, potenciadores o secuencias específicas que permitan su control bajo ciertas condiciones.
Podemos distinguir dos categorías principales en vectores usados en terapia génica: virales y no virales.
Virus
Todos los virus son capaces de introducir su material genético en la célula huésped como parte de su ciclo de replicación. Gracias a ello, pueden producir más copias de sí mismos, e infectar a otras células.
Algunos tipos de virus insertan sus genes físicamente en el genoma del huésped, otros pasan por varios orgánulos celulares en su ciclo de infección y otros se replican directamente en el citoplasma, por lo que en función de la terapia a realizar nos puede interesar uno u otro.
Algo común a la mayoría de estrategias con virus es la necesidad de usar líneas celulares "empaquetadoras" o virus helpers, que porten los genes que les eliminamos a nuestros vectores y que permiten la infección.
Retrovirus
El genoma de los retrovirus está constituido por ARN de cadena sencilla, en el cual se distinguen tres zonas claramente definidas: una intermedia con genes estructurales, y dos flanqueantes con genes y estructuras reguladoras. Cuando un retrovirus infecta a una célula huésped, introduce su ARN junto con algunas enzimas que se encuentran en la matriz, concretamente una proteasa, una transcriptasa inversa y una integrasa.
La acción de la retrotranscriptasa permite la síntesis del ADN genómico del virus a partir del ARN. A continuación, la integrasa introduce este ADN en el genoma del huésped. A partir de este punto, el virus puede permanecer latente o puede activar la replicación masivamente.
Para usar los retrovirus como vectores víricos para terapia génica inicialmente se eliminaron los genes responsables de su replicación y se reemplazaron estas regiones por el gen a introducir seguido de un gen marcador.
Del genoma vírico quedaban las secuencias LTR; y los elementos necesarios para producir los vectores a gran escala y para transformar las células son aportados desde otros vectores, bien plasmídicos o bien en líneas celulares específicas. En el caso de usar vectores plasmídicos, estrategias como cotransformar con varios plásmidos distintos que codifiquen para las proteínas del retrovirus, y que la transcripción de sus secuencias esté sometida a promotores eucariotas puede contribuir a minimizar el riesgo de que por recombinación se generen virus recombinantes.Markowitz, D., Goff, S. and Bank, A. (1988). A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. Journal of Virology 62: 1120-1124
Actualmente se buscan estrategias como la anterior para conseguir una mayor seguridad en el proceso. La adición de colas de poliadenina al transgén para evitar la transcripción de la segunda secuencia LTR es un ejemplo de esto.
Los retrovirus como vector en terapia génica presentan un inconveniente considerable, y es que la enzima integrasa puede insertar el material genético en cualquier zona del genoma del huésped, pudiendo causar efectos deletéreos como la modificación en el patrón de la expresión (efecto posicional) o la mutagénesis de un gen silvestre por inserción.
Ensayos de terapia génica utilizando vectores retrovirales para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (X-SCID) representan la aplicación más exitosa de la terapia hasta la fecha. Así, más de veinte pacientes han sido tratado en Francia y Gran Bretaña, con una alta tasa de reconstitución del sistema inmunitario. Sin embargo, ensayos similares fueron restringidos en los Estados Unidos cuando se informó de la aparición de leucemia en pacientes. Hasta hoy se conocen cuatro casos de niños franceses y uno británico que han desarrollado leucemia como resultado de mutagénesis por inserción de los vectores retrovirales, y todos menos uno de estos niños respondieron bien al tratamiento convencional contra la leucemia. En la actualidad, la terapia génica para tratar SCID continúa siendo exitosa en Estados Unidos, Gran Bretaña, Italia y Japón.
Adenovirus
Los adenovirus presentan un genoma de ADN bicatenario, y no integran su genoma cuando infectan a la célula huésped, sino que la molécula de ADN permanece libre en el núcleo celular y se transcribe de forma independiente. Esto supone que el efecto posicional o la mutagénesis por inserción no se dan en estos vectores, lo cual no quiere decir que no tengan otros inconvenientes. Además, debido al hecho de que en su ciclo natural se introducen en el núcleo de la célula, pueden infectar tanto células en división como células quiescentes.